一、鲫血清转铁蛋白推导序列分析及空间结构预测（论文文献综述）
魏珍珍[1]（2020）在《利用铁蛋白基因融合表达猪瘟病毒E2囊膜蛋白》文中研究表明“古典猪瘟”（Classical swine fever,CSF）,也被称为猪瘟（Swine fever）,是一种猪之间的高度接触性传染病,对养猪业是一个非常大的威胁。近几年来,该病不仅发病率明显增高,而且流行趋势和流行特点也越发复杂,其持续感染的情况在全世界普遍存在,这使得防控猪瘟的爆发遇到了新的瓶颈期。现有疫苗的预防效果有明显减弱的趋势,如传统的灭活猪瘟疫苗及弱毒（减毒）猪瘟疫苗存在免疫保护期短,毒力返强等缺点,而蛋白源性亚单位疫苗可以很好的解决这些问题。本研究选取具有强免疫原性的猪瘟病毒囊膜蛋白E2作为新型猪瘟疫苗的研究选材。随着交叉学科的发展,生物学与纳米材料技术的交叉渗透正日益增强,其中铁蛋白（Ferritin）自组装纳米颗粒技术引起了人们的关注。铁蛋白可自发组装形成均一、稳定的具有良好生物相容性的蛋白纳米颗粒,也因其独特的24亚基的空间结构,可成为理想的抗原呈递的多聚体纳米颗粒载体。大肠杆菌细胞E.coli（Escherichia coli,E.coli）的p ET表达系统是最常用来表达外源蛋白的,其具有清晰的遗传背景、生产成本低廉、繁殖速度快、表达产物易纯化、可高效表达外源蛋白及应用范围广等特点,但是因为是原核表达系统,所以会缺乏复杂的磷酸化、糖基化以及形成复杂二硫键等的翻译后修饰过程,对某些外源蛋白的正确折叠以及生物活性存在一定影响。本研究对猪瘟囊膜蛋白E2和铁蛋白的基因序列进行优化设计,并通过化学合成得到目的基因序列,利用融合PCR得到E2-Fe,将该基因克隆到p ET28a原核表达载体中,转化到E.coli BL21（DE3）中进行诱导条件的探索及其高效表达,将表达的融合蛋白进行Western-blotting验证、镍柱纯化、质谱及电镜检测。结果显示,融合基因E2-Fe已成功克隆到p ET-28a载体上,0.15%乳糖诱导6 h为融合蛋白表达的最优条件,Western-blotting与质谱图均显示融合蛋白的大小约51 KD与理论值相符,融合蛋白已成功在E.coli中大量表达,电镜观察到的纳米颗粒直径约为20 nm也与理论值相符,即融合铁蛋白的猪瘟病毒囊膜蛋白E2-Fe在大肠杆菌中得到高效表达。将大肠杆菌中表达的融合蛋白E2-Fe经纯化后制样腹腔注射小鼠,两次免疫后,其可诱导机体产生特异性抗体,效价可达1:6400,表明E2-Fe融合蛋白具有良好的免疫原性。杆状病毒-昆虫表达系统是重组蛋白生产的普遍选择。昆虫细胞中的蛋白表达包含翻译后修饰过程,此系统生产的蛋白质复合物以及高蛋白质产量是该真核表达系统的有利特征。后期随着研究的深入与生物技术的不断发展,杆状病毒开始在表面展示系统、基因治疗、疫苗研发等方面应用。在昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达外源蛋白时,其糖基化修饰位点是一致的,但两者在修饰时所选用的寡糖种类却不尽相同。相对于哺乳动物细胞,昆虫细胞中相关的糖链加工酶表达量不足或者缺乏,在糖基修饰加工结束后无法合成复合型唾液酸结构,而是终止于寡甘露糖结构。这种寡糖修饰差异导致在昆虫细胞中表达的亚单位疫苗在理论上是不利于生产的,但是不完全加工的N-糖链修饰反而会增强禽流感病毒血凝素（hemagglutinin,HA）病毒样粒子与免疫细胞的亲和力。因此本研究也选择杆状病毒-昆虫表达系统来融合表达目的蛋白以期研制新型猪瘟疫苗。本研究对猪瘟囊膜蛋白E2和铁蛋白的基因序列进行优化设计,并通过化学合成得到目的基因序列,利用融合PCR得到E2-Fe,将融合基因克隆到杆状病毒转移载体p VL1393的多克隆位点中,获得重组载体p VL1393-E2-Fe,将重组转移载体p VL1393-E2-Fe与失活拯救型家蚕杆状病毒（re Bm Bac）共转染家蚕Bm5细胞,获得重组病毒,收集病毒液并感染五龄起家蚕,待家蚕有明显杆状病毒发病迹象后收集蚕血淋巴,随后进行Western-blotting、电镜观察验证。结果显示,重组转移载体p VL1393-E2-Fe测序结果正确,融合基因E2-Fe已成功克隆到p VL1393,且与re Bm Bac共转染家蚕Bm5细胞后获得有感染活性的重组杆状病毒re Bm Bac-E2-Fe;蚕血的Western-blotting图显示融合蛋白的大小约46 KD与理论值相符,融合蛋白已成功在家蚕中表达,而后通过电镜观察到大量直径约为20 nm且分布较为均匀纳米颗粒,也与理论相符,即融合铁蛋白的猪瘟病毒囊膜蛋白E2-Fe在家蚕中得到了高效表达。将含有E2-Fe融合蛋白的蚕血淋巴制样后腹腔注射小鼠,经两次免疫后,可诱导机体产生高滴度的特异性抗体,其效价可高至1:25600,即本研究所得E2-Fe融合蛋白具有较好的免疫原性。以上研究结果均说明融合蛋白在大肠杆菌及家蚕中都可进行高效表达,获得数量可观的纳米颗粒抗原,这为研究新的猪瘟疫苗拓宽了思路。
滕涛[2]（2018）在《团头鲂铁稳态调控及其对嗜水气单胞菌毒力的影响研究》文中研究指明在自然界正常条件下,病原、宿主和环境三者间是处于动态平衡,机体表现为健康状态。若三者之间任何一种要素的变化,而另外两种要素未产生相应适应能力时,都会打破平衡而引起宿主健康状况的变化。团头镑（Megalobbrama amblycephala）是我国经济养殖鱼类,具有一系列优良特性,受到市场的广泛欢迎。但实际养殖过程中的多种应激胁迫（高密度、管理不善等）,导致病害频发,特别是由嗜水气单胞菌参与引起的暴发性出血病,造成水产养殖业巨大损失。嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是水产上的常见致病菌,其致病能力与毒力因子密切相关,一般认为是多功能和多因子协同致病的结果。铁是生命体必需的微量元素,在保持酶活性、电子传递等方面具有重要作用。在大多数环境中铁是有限的资源,高效摄取铁是入侵宿主的微生物生存和致病的关键。多年来,国内外分别对嗜水气单胞菌及团头鲂的铁稳态做了大量研究,对其吸收、转运、储存等部分机制有了较为清晰的认识。但大部分研究仅限于铁限制条件下嗜水气单胞菌部分毒力基因检测、膜蛋白变化、铁代谢等方面,在毒力评价、全基因表达等方面研究较少,且与宿主团头鲂细胞争夺铁的分子机制还不够明确。本实验克隆和分析团头鲂体内转铁蛋白基因,模拟不同应激条件下团头鲂机体铁稳态的变化,观察团头鲂及免疫细胞免疫指标变化情况,阐释嗜水气单胞菌与团头鲂对铁元素竞争的分子机制,为细菌性出血病的治疗提供新的思路和参考依据;同时以嗜水气单胞菌与团头结对铁离子的争夺为切入点,建立铁胁迫模型,模拟生物体内缺铁环境,通过转录组学及蛋白质组学数据分析,更为全面的探究铁限制应激条件对嗜水气单胞菌的生长及毒力的影响。试验内容主要包括以下五个部分:1团头鲂转铁蛋白基因克隆及表达分析本试验旨在研究团头鲂的转铁蛋白（transferrin,Tf）基因序列特征、组织表达分布以及铁注射和嗜水气单胞菌感染对其基因表达的影响。本文利用RACE和RT-PCR等生物技术,克隆获得团头鲂Tf（GenBank登录号:KX698308）,其cDNA序列全长2245bp,包含一个1953 bp的开放阅读框,编码650个氨基酸:保守结构预测分析表明团头鲂Tf包括两个相似的结构域,每个结构域分别由两个亚基组成:氨基酸序列分析表明团头坊Tf与GenBank中的鲤科鱼类有较高的相似性,发育树分析显示其与草鱼和鲢鱼关系最为相近;组织表达分布分析表明肝脏中Tf表达量显着高于其他组织（P<0.05）。与对照组相比（生理盐水组）,团头鲂注射1×106 CFU/ml嗜水气单胞菌后（48h）,肝脏中TfmRNA相对表达水平的总体趋势呈先上升后下降,8h表达量增加1倍,12h达到峰值;血清铁水平呈先下降后恢复正常水平,12h达到最低。注射FeC13后,肝脏TfmRNA相对表达水平的总体趋势是先上升后下降,在4 h增加2倍,8 h达到最高,而血清铁水平先上升后下降,4 h达到峰值水平,8 h恢复注射前水平。通过原核表达和体外CAS平板实验表明,团头鲂Tf具有较好的铁结合活性。从研究中发现,转铁蛋白参与先天免疫,并对外部条件变化如致病性细菌感染和铁离子浓度变化作出快速应答。2应激对团头镑铁稳态相关基因表达及免疫指标的影响本试验旨在探究不同应激源胁迫对鱼体铁稳态相关基因及免疫功能的影响。以团头鲂（250±5g）为研究对象,通过腹腔注射皮质醇、脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）来构建不同应激模型,在注射后不同时间点对团头鲂的血液、肝脏进行取样,采用分光光度法测定血清和肝脏中的铁含量,采用RT-PCR技术对肝脏铁稳态相关基因铁调素（hepcidin,Hep）和转铁蛋白（transferrin,Tf）的表达量进行检测。结果显示,与对照组相比,注射皮质醇、LPS后,血浆皮质醇和血糖含量显着升高（P<0.05）,血浆铁含量整体呈现先下降后上升的趋势,肝脏铁含量则先上升后下降。基因mRNA检测结果表明,皮质醇和LPS处理下团头鲂肝脏Hep基因和肝脏Tf基因的表达均呈先升高后下降的趋势。为研究团头鲂在应激条件下外周血白细胞免疫应答相关的分子机理,通过细胞活性验证试验选择合适的浓度（皮质醇、DFO、LPS浓度分别为4μg/ml、20μg/ml、62.5 μg/ml）,在刺激白细胞0、6、12和24h时测定白细胞ROS、呼吸爆发及免疫应答相关基因的mRNA表达差异,探讨应激源皮质醇、DFO、LPS对团头鲂体外培养免疫细胞活性的影响。发现三种应激胁迫均导致细胞ROS、爆发活性增强,四个免疫基因Hep、Il-1、Il-6、TNF-α表达量均上调。综上所述,皮质醇和LPS注射能导致团头鲂产生应激反应,铁稳态发生变化,通过降低血清铁含量、增加肝脏铁储存、基因转录提高促进转运来应对,适量皮质醇、DFO、LPS应激也能提高外周白细胞的免疫能力。3铁限制胁迫下嗜水气单胞菌体外转录组学研究本试验旨在研究嗜水气单胞菌在铁限制条件下转录组变化情况。通过设置六组不同浓度铁螯合剂2,2’-联吡啶（0,100,200,300,400,500 μmol/L）的TSB液体培养基,研究对嗜水气单胞菌NJ-35的生长影响。结果显示,铁螯合剂2,2’-联吡啶对嗜水气单胞菌生长具有较强的限制作用,显着地降低其稳定期的生长峰值（P<0.05）。500 μM浓度下,24h内完全抑制了嗜水气单胞菌的生长。根据本试验结果,选择200 μM2,2’-联吡啶作为最适铁限制浓度进行后续研究,通过RNA-Seq技术研究转录组的变化。通过分析,共鉴定到4679个基因。在铁限制胁迫下,1.5倍差异表达基因有1204个,其中601个基因差异表达上调,603个基因差异表达下调。对差异表达基因进行GO、KEGG富集分析发现,这些差异基因主要与细菌能量代谢、电子传递和铁离子转运相关通路有关。以rpoB为内参基因,通过实时荧光定量RT-PCR检测20个差异基因的表达情况,结果发现90%的基因变化趋势与转录组数据一致,验证了转录组数据的准确性。4铁限制胁迫下嗜水气单胞菌体外蛋白质组学研究本试验旨在研究嗜水气单胞菌在铁限制条件下蛋白组变化情况。试验材料与转录组研究相同,通过iTraq技术分析共得到328236张二级质谱谱图,40494张肽段匹配到的谱图,共鉴定到16417个肽段,鉴定到的蛋白质总数为2244,其中定量了 2012个蛋白。在铁限制胁迫下,1.5倍差异表达蛋白有236个,其中90个蛋白差异表达上调,146个蛋白差异表达下调,表达下调的蛋白数目多于表达上调的蛋白数目。对差异表达蛋白进行GO、KEGG富集分析发现,这些差异蛋白主要与肠菌素生物合成、铁吸收、离子运输、蛋白转运、能量代谢等相关通路有关,并通过对差异蛋白进行网络互作分析,发现差异蛋白主要集中在能量的合成、ABC转运体等蛋白群中。进一步说明了铁限制胁迫下,嗜水气单胞菌大量合成铁相关蛋白来争夺转运环境中的铁,通过消耗能量转运至细胞内,维持自身生长繁殖需要。为深入阐述嗜水气单胞菌的耐铁分子机制打下坚实的基础。5铁限制胁迫下嗜水气单胞菌体外转录组及蛋白质组学联合分析及对酶活性的影响本试验旨在研究嗜水气单胞菌在铁限制条件下转录组和蛋白组的关联变化及毒力的变化。通过转录组和蛋白组数据联合分析发现,大部分的mRNA和蛋白水平没有超过2倍的变化,证实了基因和蛋白的显着变化及其强相关性。680个对应组基因差异表达而蛋白质无差异,35个对应组蛋白质差异表达但转录基因无差异,6个差异基因和差异蛋白的表达相反,说明大部分差异蛋白与差异基因的变化趋势一致。通过对60个主要的毒力因子进行基因和蛋白聚类分析,发现铁限制胁迫对嗜水气单胞菌的毒力因子的调节有全面的影响。铁含量检测发现,在铁胁迫下嗜水气单胞菌会加强铁吸收转运,导致胞内铁含量显着高于正常组（P<0.05）。通过对嗜水气单胞菌的毒力因子的检测发现,铁限制胁迫下上清液中总蛋白酶活性显着增加至0.36,与正常组0.105相比差异显着（P<0.05）,脂肪酶活性和血平板溶血性得到了增加,但差异不显着（P>0.05）。在铁限制条件下,细菌的游泳能力得到显着增强（P<0.05）,反映了细菌试图迁移到更适宜的生长区域。通过人工感染实验发现,与正常组相比,铁限制条件下培养的嗜水气单胞菌对健康团头鲂具有更强的致死率。综上所述,在铁限制条件下,嗜水气单胞菌的毒力得到了增强。
单晓枫[3]（2013）在《乌鳢感染A.veronii差异基因的筛选及代表性基因在体内表达规律研究》文中提出乌鳢作为食补与药补于一身的名贵鱼类,在我国深受广大消费者的喜爱。近年来,随着乌鳢养殖面积的增加、集约化养殖的发展,其病害也逐年增多,尤其是细菌性疾病日趋严重,已成为制约乌鳢养殖业健康可持续发展的重大障碍。目前,有关乌鳢细菌性疾病的治疗多采用投喂抗生素的方法,但此方法易导致乌鳢体内药物残留以及细菌耐药性增加。研发新型无毒渔药与利用免疫相关基因进行抗病品系选育是乌鳢养殖业健康可持续发展的趋势,因此,必须对乌鳢抗病免疫相关基因及免疫机理进行深入研究。本研究应用SSH技术,成功构建维氏气单胞菌感染后的乌鳢头肾SSH cDNA文库,并经筛选、测序,获得有效序列202条,其中,73个序列未搜到同源性,其余129条序列按可能功能共分为6大类,免疫相关基因序列25条,占总数的13%。在乌鳢头肾SSH cDNA文库的基础上,从中选出疑似Cu/Zn-SOD、Rac2、MPO的基因片段,并利用RACE技术获得了三种免疫相关基因的全长cDNA序列,采用生物信息学方法对其理化性质、蛋白结构及氨基酸同源性进行了分析；用实时荧光定量PCR技术分析了免疫相关基因在健康乌鳢的不同组织中表达分布以及感染维氏气单胞菌后的表达变化。结果显示：Cu/Zn-SOD基因全长cDNA序列810bp,其ORF465bp、编码154个氨基酸；多重序列比较分析,Cu/Zn-SOD氨基酸序列与莫桑比克罗非鱼同源性为95%；实时荧光定量PCR分析表达显示：Cu/Zn-SOD基因在健康乌鳢的头肾、肾、鳃、心、脾、肝、肌肉、肠等八个组织中均有表达,肝脏中的表达量最高；感染维氏气单胞菌后,其在不同组织中的表达量变化大致呈现：先上升后下降并维持一段时间,后又有上升的趋势。Rac2基因全长cDNA序列1179bp,其ORF579bp、编码192个氨基酸；通过氨基酸序列比较分析,各物种Rac2高度同源；实时荧光定量PCR分析表达显示：Rac2基因在健康乌鳢的头肾、肾、鳃、心、脾、肝、肌肉等七个组织中均有表达,不在肠中表达,其中,头肾表达量最高；感染维氏气单胞菌后,Rac2在乌鳢7个组织中的表达量,随感染时间不同而发生变化,但均在感染后的36h时,表达量上调,基本超过0h时的表达量。MPO基因全长cDNA序列3181bp,其ORF2301bp、编码766个氨基酸；通过氨基酸序列比较分析,各物种MPO蛋白存在歧化；实时荧光定量PCR分析表达显示：MPO基因在健康乌鳢的头肾、肾、鳃、心、脾、肝、肌肉等七个组织中均有表达,在肠中不表达,其中,头肾表达量最高；感染维氏气单胞菌后,MPO在大多数组织中低水平表达；所有组织中一般在感染后的36h时,表达量有上升的趋势。本研究成功的构建了乌鳢头肾SSH cDNA文库,并获得了大量与乌鳢抗菌感染相关的基因片段,在此基础上,应用RACE技术获得三种免疫相关基因的全长,利用生物信息学对其进行了较为系统的分析,同时探讨了这三种基因的表达模式。研究成果为进一步了解并研究乌鳢抗菌感染的分子免疫机制奠定基础,同时为抗病品种的选育及病害防治提供了基础理论数据。
佟平,高金燕,陈红兵,李欣,简姗,张银[4]（2011）在《鸡蛋卵转铁蛋白过敏原B细胞线性表位的预测研究》文中进行了进一步梳理为预测鸡蛋过敏原卵转铁蛋白的B细胞线性表位,以GenBank中提供的鸡蛋卵转铁蛋白氨基酸序列为基础,分别用Jameson-Wolf法、Kyte-Doolittle法、Emini法和Karplus-Schulz法对鸡蛋卵转铁蛋白的抗原指数、亲水性、蛋白表面可及性及柔韧性进行预测,并用Chou-Fasman法和Deleage-Roux法预测其二级结构,综合分析以上预测结果,得出鸡蛋卵转铁蛋白可能的B细胞线性表位区。结果表明鸡蛋卵转铁蛋白存在7个潜在表位区,包括蛋白第174～181、215～222、231～240、288～294、332～344、415～429、547～555位可能为B细胞线性表位优势区域。该结果将有助于鸡蛋卵转铁蛋白B细胞表位的进一步精确定位。
庄志凯[5]（2011）在《凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶分离纯化与酶学特性研究》文中研究表明虾头是去头虾、虾仁等产品加工过程中的副产物,全国年产虾头约20万吨,其中凡纳滨对虾虾头占70%。虾头不仅含有丰富的蛋白质等营养成分,还含有丰富的内源蛋白酶,这些蛋白酶在一定条件易导致虾头发生自溶作用,造成虾头腐烂变质,致使虾头得不到高值化利用,这不仅造成了资源的浪费,而且带来了严重的环境污染。为了深刻认识虾头内源酶的特性,有效保持虾头贮藏过程中的品质,充分利用虾头内源蛋白酶廉价回收虾头蛋白等营养成分提供基础数据,本论文首先研究了虾头内源蛋白酶活性随pH的变化规律,确定了虾头中存在两类内源性蛋白酶,其最适pH分别为2.0和8.0,在此基础对两类内源性蛋白酶的提取纯化和酶学特性进行了系统研究,并采用液相-质谱联用技术对这两种蛋白酶的同源性进行了初步分析,主要研究结果如下:1、以温度、pH和料液比等单因素对凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶活性影响结果为基础,采用正交实验对凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶最佳提取工艺条件进行了优化,并对两类内源蛋白酶硫酸铵分级沉淀的最佳饱和度进行了研究。结果表明:酸性蛋白酶最佳提取条件为缓冲溶液pH3.0,料液比1:2,温度30℃。酸性蛋白酶硫酸铵一级沉淀的饱和度为10%,硫酸铵二级沉淀饱和度为50%;碱性蛋白酶最佳提取条件为缓冲溶液pH8.0,料液比1:3,温度50℃。碱性蛋白酶硫酸铵一级沉淀饱和度为20%,硫酸铵二级沉淀饱和度80%。2、采用Q- Sepharose F. F阴离子交换层析和Sephadex G-150凝胶过滤层对凡纳滨对虾虾头内源碱性蛋白酶进行了纯化,并用SDS-PAGE对纯度与分子量进行了评价。结果表明,纯化后的碱性蛋白酶比活为1386.16U/mg,纯化倍数达到了26.50,得率为32.8%,分子量为79.95kDa。3、采用Sephadex G-100凝胶层析和DEAE-Sepharose F.F阴离子交换层析对凡纳缤对虾虾头内源酸性蛋白酶进行了纯化,并用SDS-PAGE对纯度与分子量进行了评价。结果表明,纯化得到电泳纯级的内源酸性蛋白酶,其比活为698.09U/mg,纯化倍数达到15.7倍,得率为20.20%,分子量为27.45kDa。4、凡纳缤对虾虾头内源碱性蛋白酶酶学特性研究结果表明,该酶最适pH和最适温度分别为8.0和50℃,热稳性定较好,动力学参数Km和Vmax值分别为2.54g/L和7.11μg/min,金属离子Fe3+、Mn2+、Hg+,TryPsin inhibitor均能完全抑制其活性,DTT对其有激活作用,该蛋白酶属于胰蛋白酶酶类。5、凡纳缤对虾虾头内源酸性蛋白酶酶学特性研究结果表明,该酶最适pH和最适温度分别为3.0和30℃,热稳定性和pH稳定性均较差,动力学参数Km和Vmax值分别为2.01g/L和26.39μg/min,金属离子Hg+,Pepstatin A和EDTA均能完全抑制其活性,Ca2+对其有激活作用,该酶属金属蛋白酶,性质类似于胃蛋白酶类。6、采用分子荧光法和傅里叶红外光谱法研究了凡纳缤对虾虾头两类内源蛋白酶空间构象特性,结果表明,在λex = 278nm和295nm为激发波长条件下,内源碱性蛋白酶随着pH和离子强度的增大荧光强度上升,但荧光发射峰的位置并未发生移动,不过内源酸性蛋白酶二级结构发生了改变。在红外光谱扫描范围为900-1700cm-1,分辨率为为4cm-1条件下,两种内源性蛋白酶红外光谱都呈现出α-螺旋和β-折叠的特征,但两类蛋白酶谱带数据有所差异。7、利用LC-ESI-MS/MS对凡纳滨对虾虾头两类内源性蛋白酶同源类进行了初步分析,将检测到两种内源性蛋白酶的部分氨基酸序列分别与不同物种的胰蛋白酶和胃蛋白酶氨基酸序列于Vector NTI suite 8.0软件上进行序列比对,结果表明,发现凡纳滨对虾虾头内源碱性蛋白酶与猪的胰蛋白酶具有很高的同源性,均含有氨基酸序列LSSPATLNSRVATVSLPR;凡纳滨对虾虾头内源酸性蛋白酶与非洲蟾蜍的胃亚蛋白酶具有很高的同源性,均含有氨基酸序列EFGLSETEPGTNF。
杨长庚[6]（2011）在《大菱鲆（Schophthalmus maximus）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）免疫相关基因的克隆及其性质与功能的研究》文中提出大菱鲆、牙鲆是我国重要的海水经济养殖鱼类。近年来,养殖环境的日益恶化导致了养殖病害频发,不但造成了巨大的经济损失,而且还严重制约了相关养殖产业的健康发展。在鱼类对外界刺激及病原物侵袭的防御反应中,非特异性免疫起着重要作用。因此,利用分子生物学及基因工程手段研究鱼类免疫相关基因的功能及其网络调控过程,对于揭示鱼类抗病机理、开发鱼类抗病种质及研发用于鱼类疾病治疗的抗病工程制剂和药物等方面具有重大的理论意义和社会价值。抗菌肽（AMPs）在鱼体与病原生物不断抗争的过程中起到固有防御的作用。在众多的抗菌肽中,Hepcidin是一种研究的较为详细的小分子抗菌肽,它同时还具有调控细胞中铁离子浓度的作用。NF-κB位于Toll样受体（Toll-like receptor,TLR）下游信号通路的枢纽位置,当细胞受到病原体刺激后产生应激反应,激活NF-κB,活化的NF-κB进入细胞核调节炎症细胞因子的表达,启动针对病原微生物的固有免疫和获得性免疫。Akirin作为一个NF-κB途径中的新成员已被确定参与此途径。本文围绕大菱鲆、牙鲆免疫相关基因的功能及其调控网络,以大菱鲆中两个免疫相关基因（SmHepcidin和SmAkirin1）及牙鲆中PoAkirin1基因为研究对象,开展了相关基因的性质与功能的研究。首先,分别利用RACE技术和基因组步移的方法获得了SmHepcidin的mRNA全长和启动子区序列。序列分析结果表明,该启动子区域含NF-κB转录因子结合位点,双荧光素酶实验结果进一步证明了SmHepcidin可能对NF-κB具有反馈调节作用。此外,外源添加Hepcidin蛋白可以调控细胞中铁离子含量的实验进一步验证了Hepcidin的功能。为明确SmHepcidin的网络调控过程,本研究克隆了SmHepcidin调控相关因子SmFPN1（Ferroportin 1）和SmTFR2（Transferrin Receptor 2）的全长cDNA序列,并利用荧光实时定量PCR检测细菌或病毒感染以及注射外源Hepcidin蛋白情况下肝、脾、肾组织中SmHepcidin、SmFPN1、SmTFR2的表达变化。结果表明,伴随着SmHepcidin表达量的升高,SmFPN1表达明显降低,SmTFR2表达有所降低或变化不明显。利用RNAi的方法对Hepcidin基因沉默的大菱鲆肾脏细胞中这三个基因的表达模式进行了研究,结果同样证实了上述基因表达规律。通过以上实验结论及前人的研究结果,我们推测SmHepcidin、SmFPN1、SmTFR2三者在调控铁离子平衡过程中起重要作用,同时在大菱鲆抵抗外源病原物过程中,SmHepcidin的表达迅速增加,影响其他相关基因变化,改变细胞中铁离子浓度,从而对外界刺激及病原物侵袭起到防御作用。其次,我们利用RACE技术获得SmAkirin1基因全长。蛋白预测表明SmAkirin1是一种核蛋白。利用SmAkirin1-GFP及SmAkirin1-m-GFP融合蛋白质粒转染大菱鲆肾脏细胞系,证实了SmAkirin1的核定位信号（NLS）存在于蛋白N末端,虽然该蛋白定位于核内,并参与免疫效应基因的调控,但是自激活实验结果表明SmAkirin1不具有自激活活性,不是一种转录因子。利用荧光实时定量PCR方法检测了细菌或病毒感染后,大菱鲆的肝、脾、肾组织以及大菱鲆肾脏细胞系中SmAkirin1的表达情况,结果表明SmAkirin1的表达受到细菌及病毒诱导。在与牙鲆免疫相关基因的研究中,我们构建了牙鲆酵母双杂交cDNA文库,该文库的原始库容量为约1.6×106 cfu/mL,初级文库甘油保存液滴度约为4.1×104 cfu/1.8mL,扩增放大文库库容约为5.00×1010 cfu/mL。转化酵母细胞后容量为:5.4×106 cfu/mL。从文库中我们发现多种免疫相关基因并克隆到PoAkirin1基因全长。随后使用PoAkirin1作为诱饵筛选与其相互作用的蛋白质:筛选得到49个阳性克隆,获得了7个可能相互作用的基因。从中选择了2个可能与免疫相关或者是蛋白预测后位于细胞核中的蛋白进行了酵母回转验证及分段验证,结果表明,这两个蛋白——PoC1q以及PoHEPN能够与PoAkirin1相互结合,其中PoHEPN与PoAkirin1的互作位点可能位于其N末端。通过荧光实时定量PCR检测细菌感染牙鲆的肝、脾、肾组织中PoAkirin1,PoC1q以及PoHEPN的表达变化,结果表明这三种基因均受到外源病原物的诱导,通过其响应时间的不同推测它们可能处于免疫信号转导途径的不同位置。最后,构建了PoAkirin1,PoHEPN的原核表达重组质粒,并在大肠杆菌中进行了原核表达,为进一步验证PoAkirin1与PoHEPN相互作用及揭示其性质与功能奠定了基础。
李前勇[7]（2010）在《猪铜蓝蛋白的纯化、性质、功能及其基因克隆与表达研究》文中进行了进一步梳理铜蓝蛋白（Ceruloplasmin, EC1.16.3.,缩写为CP）是一种含铜的α2糖蛋白,广泛存在于人和动物体内,是人和动物生命活动中的一种重要金属蛋白酶,在动物体内铜的转运、细胞铁的代谢、胚胎及神经系统的发育、新生毛细血管的形成、自由基的清除等过程中发挥重要作用。铜蓝蛋白可以向机体各种组织细胞快速提供高效可利用的铜,满足各器官组织对铜营养的需要,经母乳在初生动物的早期阶段发挥了重要的营养作用,这些科学结论为将铜蓝蛋白作为畜禽的一种新型生物铜源进行开发利用提供了重要线索。猪是我国畜牧业中饲养最多、分布最广的一种重要家畜,铜不仅是其机体必需的微营养素,而且在一定的范围内高剂量的铜还作为一种重要促生长剂广泛使用,甚至滥用,无机铜的超量使用或滥用已经导致了猪发生铜中毒病、猪肉品质下降、养殖环境土壤板结、水体自洁力下降、铜资源严重浪费及影响人类健康等负面效应。因此,开发安全高效、经济适用、环境友好的畜禽生物铜源有着广阔的应用前景。本研究以我国着名三大优良地方猪种——荣昌猪为试验材料,通过对猪血清铜蓝蛋白的分离纯化、生化特性、抑制动力学、部分功能以及对该蛋白质原基因克隆、生物信息学分析、荧光定量PCR表达量分析等的研究,获得了以下结果：1.采用25%的正丁醇脱脂、35-50%的饱和硫酸铵盐析、截留分子量为10000D的滤膜超滤、DEAE-Sepharose层析、羟基磷灰石柱层析、Superdex-200凝胶柱层析等技术对猪铜蓝蛋白进行了分离纯化,并用邻联大茴香胺检测法监测各纯化步骤溶液中铜蓝蛋白的酶活性,获得了经SDS-PAGE电泳为单带的铜蓝蛋白纯化产物,其酶的比活力提高了217.65倍,回收率达到32%。该蛋白分子量为123.5KD,等电点为5.08,含糖量为7.8%,每分子猪铜蓝蛋白分子中含有铜原子个数为6个,经SDS-PAGE电泳分析,该猪CP为单亚基蛋白质。酶促反应研究得知,所得猪铜蓝蛋白（氧化酶）的最适pH为5.5,pH5-10为其稳定环境；最适温度为55℃。在50～60℃下其酶活力稳定性最好。经对猪铜蓝蛋白（氧化酶）酶促反应常数研究,得出其酶促反应的初速度为24.75gmol／（L·min）,Km值为0.95mmol／L,最大反应速度Vmax为0.1124μmol／L。2.研究了效应物对猪铜蓝蛋白酶活力的影响,结果表明猪铜蓝蛋白对胰蛋白酶、胃蛋白酶均有明显的抵抗能力；铜离子、铁离子、锌离子、锰离子和镁离子对铜蓝蛋白的酶活力均有抑制作用,并呈现随着这些金属离子浓度的增加该蛋白质的酶活力逐渐减弱的趋势；氯离子、EDTA、双氧水及叠氮化钠对猪铜蓝蛋白的酶活力也明显的抑制作用,其中叠氮化钠的抑制作用最强,EDTA的抑制作用最弱；柠檬酸、草酸、抗坏血酸对猪铜蓝蛋白的酶活力有抑制作用,并呈现浓度依赖关系,其中抗坏血酸对铜蓝蛋白的酶活力抑制作用为非竞争抑制作用,柠檬酸对铜蓝蛋白的酶活力抑制作用为竞争抑制作用,而尿素对该蛋白质的酶活力基本无明显的抑制作用。3.研究了铜蓝蛋白对猪脑垂体细胞分泌生长激素及对脾细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和亚群（CD4、CD8）增殖的影响,结果表明铜蓝蛋白可以促进猪脑垂体细胞生长激素的分泌,其中以加入0.4mg／ml的铜蓝蛋白换液培养8h的效果最好；同时,铜蓝蛋白可显着促进脾细胞、T淋巴细胞及亚群（CD4、CD8）、B淋巴细胞的增殖,其中以1.0mg/mL（终浓度为0.5mg/mL）的效果最好。这一结果说明铜蓝蛋白在细胞水平不仅可以促进猪垂体细胞分泌生长激素,还具有有丝分裂原的作用,可以刺激仔猪脾细胞、T淋巴细胞及亚群（CD4、CD8）、B淋巴细胞的分裂、增殖,提高仔猪免疫能力。研究结果丰富了铜蓝蛋白生理功能的内容,同时也为铜蓝蛋白作为一种新型有机生物铜源的开发和应用奠定了基础。4.给试验小鼠补充不同浓度的猪铜蓝蛋白研究了铜蓝蛋白对小鼠机体抗氧化能力及Cu-ATPase的影响,结果显示铜蓝蛋白可明显提高小鼠机体总抗氧化能力、Cu-ZnSOD的活性,提高小鼠肝脏组织中一氧化氮含量,减少机体丙二醛的含量,其中以腹腔注射4mg/只的效果最优,但对小鼠肝脏谷胱甘肽过氧化物酶活力作用不显着：铜蓝蛋白可有效提高小鼠肝脏组织中铜--ATP酶的含量,其中以腹腔注射4mg／只的效果最优。这一研究结果对铜蓝蛋白功能提供了的有益补充。5.通过RT-PCR技术,克隆了荣昌猪铜蓝蛋白基因,序列已登录在GenBank上,登录号为EU714006,基因cDNA长度为3181bp。其最大开放阅读框长度为3180bp,编码1060个氨基酸残基。经与家猪基因组序列比对分析,预测出猪铜蓝蛋白基因位于第13号染色体上,横跨于该染色体基因的42.463Kb-95.199Kb之间,有20个外显子、19个内含子。其推导的氨基酸序列与21个物种CP氨基酸序列比对分析,结果克隆出的猪CP氨基酸序列人CP的同源性最高,达到89%,而与与紫色海胆相似于CP的蛋白的氨基酸的同源性最低,仅为19.2%。经生物信息学软件预测,该蛋白质在19aa--20aa处有较强的信号肽,但无跨膜结构。系统进化树分析表明该基因存在较大的种属差异,但与人、马的亲缘关系较近,反映了在-定程度上该基因受到了人工选择压力的影响。6.通过对铜蓝蛋白基因在荣昌猪脑、心、肺、肝、脾、胃、肠、肾、膀胱及肌肉10种内脏器官组织中的荧光定量PCR表达谱差异比较分析,结果表明在1、15、30、45及60日龄5个不同生长阶段中,铜蓝蛋白基因在同一个器官的表达有差异；而在同一个生长阶段,该蛋白质基因在上述10个器官组织中的表达也有差异。初步揭示了铜蓝蛋白基因在仔猪5个生长阶段中可能具有参与铜的吸收和转运、促进免疫、调节机体铜代谢等功能。本课题获得的猪铜蓝蛋白理化特点及酶学特性、在细胞水平促进垂体生长激素的分泌及免疫细胞的增殖、提高机体CuZn—SOD及Cu—ATP酶活力、该蛋白质的原基因序列及基因在5个生长阶段不同内脏器官中的表达特点等研究结果,为猪铜蓝蛋白作为畜禽的一种新型高效、经济安全、环境友好的生物铜源的开发和利用提供重要的理论依据。
甘云飞[8]（2008）在《萍乡红鲫转铁蛋白研究》文中认为萍乡红鲫（Pingxiang red-transparent crucian carp,Carassius auratus var.Pingxiangnesis）是江西省萍乡的一种野生鲫鱼突变种。经过七年的工作,已经完成了对其6代的选育。选育后的萍乡红鲫具有生长速度快、适应性强、营养价值高、易养易繁、抗病力强等优良经济性状,2008年被全国水产原、良种审定委员会审定为新品种。实验以萍乡红鲫的血清转铁蛋白（TF）为对象,通过电泳研究该鱼TF的表型、分子量等遗传性质;通过同源克隆得到该鱼TF-cDNA的序列,以期了解其遗传背景,为进一步的科学研究提供资料。本文的工作主要为:一、对萍乡红鲫的血清转铁蛋白（Transferrin,简称TF）进行电泳分析。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）发现随机选取的12尾萍乡红鲫TF表型完全的相同,个体间没有差异;萍乡红鲫的TF表型为两个条带,推测可能由一个座位上的二个等位基因遗传决定。采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对TF进行分析得出其分子量大约为71KDa。经人工选育的萍乡红鲫TF表型一致,种群内未见多样性,认为其遗传性状趋于稳定纯系;萍乡红鲫不同个体间完全致的TF表型及分子量,可以利用TF雌核发育鉴定的遗传标记揭示萍乡红鲫具有雌核发育的生殖方式。二、为进一步了解了萍乡红鲫TF的分子机制,利用RT-PCR和RACE-PCR克隆出萍乡红鲫TF互补基因,克隆得到的TF-cDNA包含完整的开放阅读框（open reading frame,ORF）,肉红鲫TF-cDNA长2364碱基对（base pair,bp）,包括8bp的5′非编码区（untranslated region,UTR）,355bp的3’UTR,编码666个氨基酸,理论信号肽切割位点位于15-16个氨基酸之间,预测的分子量为71.9,没有潜在的糖基化位点,还有34个半胱氨酸残基。结果分析表明萍乡红鲫TF遗传性质与彩鲫A、银鲫E同源性较高。最后对萍乡红鲫TF蛋白序列进行二级结构理论分析和三级结构的同源建模。
赵文明[9]（2008）在《鹅GH、PRL基因序列及其多态性与早期生长发育及屠宰性状的关联分析》文中研究指明本试验对我国大、中、小三个地方鹅种狮头鹅、皖西白鹅和籽鹅的早期生长发育规律进行分析,同时以籽鹅、皖西白鹅、狮头鹅、四季鹅和浙东白鹅为研究对象,对GH基因外显子和内含子、PRL基因编码区全序列以及5’端序列进行PCR-SSCP检测和克隆测序,分别计算5个鹅品种（种群）突变位点的基因型频率和基因频率,比较不同鹅种间的基因型分布规律,并对GH基因和PRL基因多态性与鹅早期增重和屠宰性状进行关联分析。试验结果如下:1.利用Logistic,Gompertz,Bertalanfy和Cubic 4种非线性动物生长模型拟合大、中和小型三个地方鹅种:狮头鹅、皖西白鹅和籽鹅1-11周龄的平均体重,进行早期生长发育规律及遗传参数分析。结果表明:4个方程均能很好地拟合三个鹅种的生长过程,拟合度都在0.99以上,但Gompertz模型更符合实际品种特性,为首选模型,由此模型估计狮头鹅、皖西白鹅和籽鹅生长的拐点时间分别为5.98周龄、5.11周龄和6.16周龄,相应的拐点体重分别为2115.77g、1499.08g和1049.62g。2.对鹅GH基因外显子和内含子进行克隆测序,得到鹅GH基因编码区全序列,长度为651bp。与鸡GH基因cds的同源性为91.4%,与鸭的同源性高达98.5%,演绎成氨基酸后两者同源性分别为97.6%和99.9%;与人、鼠GH基因cds序列同源性分别为63.81%和74.31%,演绎成氨基酸后同源性分别为52.51%和72.81%。并获得了鹅GH基因4个内含子的序列,序列长度分别为1504bp、664bp、362bp和1144bp。3.在鹅GH基因编码区上共检测到4个SNP位点,分别为外显子2的C39T、C74T突变和外显子4的T291C、G297C,仅外显子2的C74T突变导致导致编码的氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸,其余位点均为“沉默”突变。外显子2多态性分析结果显示,籽鹅和皖西白鹅具有10种基因型,狮头鹅和四季鹅具有7种基因型,浙东白鹅具有8种基因型,在籽鹅、皖西白鹅和四季鹅中等位基因A为优势等位基因,狮头鹅和浙东白鹅中等位基因D为优势等位基因;外显子4多态性分析结果显示,所有5个鹅品种（种群）均具有3种基因型,除籽鹅外,其它4个品种（种群）中等位基因A均为优势等位基因。外显子多态位点上,所有鹅品种（种群）均处于Hardy– Weinberg平衡状态。4. 4个内含子的7对引物扩增结果具有多态性,测序结果表明,内含子1的P6引物的SNP位点分别为A1066G和C1157T;内含子2的P10引物的SNP位点分别为C548T和T551C,P11引物的SNP位点分别为C548T和T551C;内含子3的P13引物多态性是由该段序列中的5个核苷酸的点突变和缺失造成,分别为A160G和C167G和T264C突变以及176bp处和231bp处分别存在两个碱基的重复和缺失。内含子4的P15的SNP位点为T130C;P18引物的SNP位点分别是G821A和C949T;P19引物的SNP位点为T1137C。在内含子1中只有P6对引物存在多态性,多态性分析结果显示,籽鹅和皖西白鹅具有4种基因型,狮头鹅、浙东白鹅和四季鹅具有3种基因型,在5个鹅品种（种群）中等位基因A均为优势等位基因;内含子2的P10和P11对引物存在多态性且基因型完全对应;所有5个鹅品种（种群）均具有3种基因型,除籽鹅外,等位基因A均为优势等位基因;内含子3的P13对引物存在多态性,狮头鹅、籽鹅和皖西白鹅具有3种基因型,浙东白鹅和四季鹅具有2种基因型,在5个鹅品种（种群）中等位基因B均为优势等位基因;内含子4的P15、P18和P19检测到多态性;引物对P15除四季鹅外,其它4个品种具有3种基因型,在5个鹅品种（种群）中等位基因A均为优势等位基因;内含子4引物对P18皖西白鹅、浙东白鹅和四季鹅具有5种基因型,狮头鹅具有4种基因型,而籽鹅只具有3种基因型,在5个鹅品种（种群）中,狮头鹅等位基因E均为优势等位基因,而籽鹅不具有E等位基因,浙东白鹅E等位基因的频率也相对较高;引物对P19皖西白鹅、浙东白鹅、籽鹅和四季鹅具有3种基因型,而狮头鹅只具有2种基因型,在5个鹅品种（种群）中,籽鹅和四季鹅M为优势等位基因,而皖西白鹅、浙东白鹅和狮头鹅N为优势等位基因。在内含子4引物对P19的多态位点中,只有籽鹅和四季鹅处于Hardy– Weinberg平衡状态（P>0.05）;其它内含子多态位点中,所有鹅品种（种群）均处于Hardy– Weinberg平衡状态（P>0.05）。5.对鹅GH基因所有检测到的SNPs的多态性与早期体重和屠宰性状进行关联分析,结果表明鹅GH基因外显子2、内含子3和内含子4的多态位点上对早期增重和屠宰性状存在显着的基因型效应,对于鹅早期增重和屠宰性状,外显子2的多态位点CD和DD基因型是有利基因型,在狮头鹅和浙东白鹅中的优势等位基因D可能是有利基因。内含子3的多态位点上最有利基因型是BB基因型。内含子4上NN基因型对鹅生长具有一定的促进作用,N基因可能是鹅早期增重和屠宰性状的有利基因。6.利用多对引物扩增的方式,本试验克隆测序了鹅PRL基因编码区以及5’端调控区的全序列,cds序列全长为690bp,5’端序列全长为836bp。将所获得序列与鸡和鸭的PRL基因cds序列比较,发现与鸡PRL基因cds序列的同源性为92.8%,与鸭的同源性高达98.7%,演绎成氨基酸后两者同源性分别为93.3%和98.3%。7.在鹅PRL基因的5’端调控区检测到C135G、C201T、C278Abp和T827G突变,在内含子2的32bp和33bp处检测到2个核苷酸GA的缺失/插入,但是在编码区没有发现突变位点。多态性分析结果5′端调控区引物对P3中,籽鹅、皖西白鹅和狮头鹅具有3种基因型,四季鹅和浙东白鹅只具有2种基因型,在5个鹅品种（种群）中等位基因A均为优势等位基因;内含子2多态位点所有5个鹅品种（种群）除浙东白鹅外均具有3种基因型,在5个鹅品种（种群）中等位基因B均为优势等位基因;所有多态位点中,所有鹅品种（种群）均处于Hardy– Weinberg平衡状态（P>0.05）.8.对于鹅早期增重和屠宰性状,PRL基因仅仅在5’端调控区的多态位点上存在显着的基因型效应,AA和AB基因型的个体610周龄体重显着高于BB基因型个体,AA和AB基因型的个体间610周龄体重差异不显着;对于屠宰性状而言,AA和AB基因型的个体活重、屠体重、半净膛重、全净膛重和内脏重也显着高于BB基因型个体,AA和AB基因型的个体间屠宰性状差异不显着。因此,对于鹅早期增重和屠宰性状, AA和AB基因型为有利基因型。
苏建明[10]（2007）在《草鱼肠道组织消减cDNA文库的构建及免疫相关基因的克隆与表达分析》文中提出草鱼肠道组织消减cDNA文库的构建及免疫相关基因的克隆与表达分析鱼类生活在一个水体环境,其大面积的黏膜是病原感染鱼类时最先接触的部位,它们产生的黏膜免疫反应是鱼类参与免疫应答过程的一个重要组成部分。本研究通过人工灌注嗜水气单胞菌,采用抑制性消减杂交（SSH）的方法构建了草鱼肠道组织差异表达消减cDNA文库,并对cDNA文库克隆进行了部分测序,测序结果进行了同源性搜索和功能的分类。同时,对参与肠道组织免疫相关因子组织相容性复合物（MHC-Ⅱα）、Alpha-1-微球蛋白/bulinin前体蛋白基因的cDNA全长进行克隆、序列分析,探讨了它们在草鱼不同组织中的表达分布。这些阶段性研究为进一步研究、阐释鱼类黏膜免疫机制积累了重要材料。本文的研究内容和结果主要包括以下几个方面:1.消减cDNA文库构建及其序列分析采用抑制性消减杂交技术,构建了草鱼肠道组织在细菌诱导条件下和未诱导条件下,两个不同生理状态的消减cDNA文库,随机挑取211个cDNA克隆进行了单向测序,共获得有效cDNA序列147个。序列同源性搜索结果显示,在147个有效cDNA序列中,有97个克隆与GenBank中的已知功能序列具有较高的同源性,其中包含28条MHC类EST序列;17个与未知功能的序列有一定的同源性;33个序列在Blast搜索中没有找到任何对应的相似序列,可能是没有鉴定的EST。97个已知功能的EST分别属于46个不同的基因。根据Adams对功能基因的分类方法,所获得EST分为8类,蛋白质与基因表达、信号传导、细胞结构与运动、代谢、细胞防御、细胞分裂和其它未知功能的蛋白,在本实验获得的EST分类,细胞防御类cDNA序列所占比例最高,为序列总数的27.2%,其次为信号传导和代谢,分别为12.9%、12.2%,蛋白质与基因表达为11.6%。细胞结构与运动、细胞分裂两者所占比例相对偏低,说明在外源刺激的条件下,肠道组织细胞的防御、信号传导、代谢、蛋白质与基因表达相关因子都有一定的表达上调,特别是与防御相关因子。2.草鱼肠道免疫相关基因MHC-Ⅱα的cDNA的克隆及序列分析根据草鱼消减文库获得的EST序列（GenBank Acc No:EW688194）设计特异性引物,分别用5’-RACE和3’-RACE的方法获得MHC-Ⅱα基因的全长cDNA序列（GenBank Acc No:EU186148）。采用生物信息学分析了MHC-Ⅱα基因cDNA序列的结构组成特点,结果表明,所获得的MHC-Ⅱα基因cDNA全长为1007bp,开放阅读框长度为717bp;可编码238个氨基酸;5’非翻译区34bp,3’非翻译区256bp;在nt962-967有一个AATAAA加尾信号。由MHC-Ⅱα基因cDNA推断的氨基酸序列编码蛋白的等电点为4.92,分子量为26.4KDa。在序列的前部分存在一个由20个氨基酸组成的信号肽,在第210-232位存在一个跨膜区。氨基酸序列比较结果,草鱼MHC-Ⅱα氨基酸序列与鲤鱼MHC-Ⅱα相似性最高,其次为斑马鱼,与比较的序列中的护士鲨相似性最低。系统进化聚类分析研究表明,草鱼与鲤鱼、斑马鱼进化亲缘关系最近,与护士鲨、非洲鲷亲缘关系较远。RT-PCR半定量分析组织中的表达分布,诱导后结果显示,MHC-Ⅱα在脾脏、头肾、后肠有较高的表达,在肝脏表达较低,在肌肉中几乎不表达。3.草鱼肠道组织免疫相关基因Alpha-1-microglobulling precursor,AMBP全长cDNA克隆与序列分析根据草鱼消减cDNA文库获得的EST序列（Genbank Acc No:EW688152）为基础设计特异性引物,采用5’RACE和3’RACE方法,经拼接获得AMBP基因全长cDNA序列（Genbank Acc No:EU186151）。AMBP基因cDNA全长序列为1230bp,开放阅读框为1047bp,可编码348个氨基酸。cDNA序列组成上,在3’端存在2个不稳定的信号ATTTA和一个加尾信号AATAAA。生物信息学方法对AMBP基因cDNA分析表明,AMBP编码的蛋白质等电点为6.27,分子量为38.84KDa。在AMBP中存在一个由18个氨基酸组成的信号肽,但没有预测到跨膜区域。经Swiss-Model预测发现AMBP的空间结构由两个不同的结构域组成,一个属于lipocalin家族蛋白的α-1-微球蛋白,一个为胰蛋白酶抑制剂（Bikunin）。经Clustal W同源性序列比较发现,AMBP氨基酸序列在相近物种中具有较高的保守性。系统进化树明显分为二大支,草鱼的AMBP与斑马鱼亲缘关系最近,其次是大西洋鲑鱼和虹鳟,在进化上它们共聚为一个大支,人、鼠、牛、猪它们在进化上相近,聚为一大支。细菌诱导条件下,半定量RT-PCR分析草鱼AMBP在不同组织的表达结果表明,草鱼AMBP在肝脏中表达最高,在脾脏、肾脏中有中等强度的表达,心脏、肠道表达较弱,鳃、肌肉组织几乎不表达。
二、鲫血清转铁蛋白推导序列分析及空间结构预测（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鲫血清转铁蛋白推导序列分析及空间结构预测（论文提纲范文）
（1）利用铁蛋白基因融合表达猪瘟病毒E2囊膜蛋白（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 猪瘟疫苗的研究现况 |
| 1.1.1 猪瘟病毒 |
| 1.1.2 猪瘟病毒的致病机理 |
| 1.1.3 猪瘟疫苗的现况 |
| 1.2 铁蛋白 |
| 1.2.1 铁蛋白的结构及其修饰 |
| 1.2.2 重组铁蛋白的人工制备 |
| 1.2.3 铁蛋白纳米颗粒的应用 |
| 1.3 大肠杆菌表达系统 |
| 1.3.1 大肠杆菌的遗传背景 |
| 1.3.2 优化大肠杆菌表达系统的方法 |
| 1.4 杆状病毒表达系统 |
| 1.4.1 杆状病毒 |
| 1.4.2 杆状病毒表达系统 |
| 1.4.3 杆状病毒表达系统研究现状 |
| 1.4.4 杆状病毒表达系统的应用 |
| 1.5 研究内容和意义 |
| 1.5.1 研究的主要内容 |
| 1.5.2 研究目的及意义 |
| 第2章 E2-Fe融合蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验材料和试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 常用试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 猪瘟囊膜蛋白E2基因及铁基因的获取 |
| 2.2.2 重组表达质粒p ET28a-E2-Fe及基因工程菌的构建 |
| 2.2.3 核酸快速抽提法粗筛阳性克隆 |
| 2.2.4 蛋白E2及融合蛋白E2-Fe在大肠杆菌中的表达及纯化 |
| 2.2.5 制备小鼠多克隆抗体 |
| 2.2.6 ELISA法检测小鼠血清抗体效力 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 构建原核表达质粒p ET28a-E2-Fe及基因工程菌的构建 |
| 2.3.2 E2-Fe融合蛋白在E.coli BL21 中的表达鉴定及其表达量的条件优化 |
| 2.3.3 E2-Fe融合蛋白的纯化及电镜观察 |
| 2.3.4 小鼠血清抗体效价检测 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 总结 |
| 第3章 重组融合蛋白E2-Fe在家蚕中表达 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验材料及试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 猪瘟囊膜蛋白E2基因及铁蛋白基因的获取及合成融合基因E2-Fe |
| 3.2.2 构建重组杆状病毒转移载体p VL1393-E2-Fe |
| 3.2.3 构建重组杆状病毒r Bm Bac-E2-Fe及在家蚕中表达 |
| 3.2.4 制备小鼠多克隆抗体 |
| 3.2.5 ELISA法小鼠血清抗体效力检测 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 鉴定重组转移载体的构建 |
| 3.3.2 构建重组杆状病毒 |
| 3.3.3 在家蚕生物反应器中表达融合蛋白 |
| 3.3.4 重组杆状病毒侵染家蚕后融合蛋白E2-Fe表达的鉴定 |
| 3.3.5 E2-Fe融合蛋白的纯化及电镜观察 |
| 3.3.6 小鼠血清抗体效价检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 总结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 1 |
| 附录 2 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（2）团头鲂铁稳态调控及其对嗜水气单胞菌毒力的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 常用缩略语 |
| 绪论 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 鱼类铁稳态分子机制的研究进展 |
| 1.1 鱼类微量元素代谢 |
| 1.2 鱼类铁吸收系统研究 |
| 1.2.1 转铁蛋白 |
| 1.2.2 铁调素 |
| 1.3 应激与鱼体铁稳态 |
| 1.3.1 应激的概念 |
| 1.3.2 应激因素 |
| 1.3.3 应激对鱼体铁稳态的影响 |
| 1.3.4 应激在水产动物上的研究 |
| 2 铁与细菌毒力的研究进展 |
| 2.1 细菌铁吸收系统 |
| 2.1.1 亚铁离子转运系统 |
| 2.1.2 血红素转运系统 |
| 2.1.3 铁载体转运系统 |
| 2.1.4 铁载体共生 |
| 2.1.5 铁载体受体 |
| 2.1.6 TonB系统 |
| 2.1.7 Fur蛋白 |
| 2.1.8 铁离子解离与储存 |
| 2.1.9 小结 |
| 2.2 细菌毒力系统的研究进展 |
| 2.2.1 细菌侵染鱼体致病机制研究 |
| 2.2.1.1 粘附 |
| 2.2.1.2 侵袭 |
| 2.2.1.3 胞内定殖 |
| 2.2.2 细菌的毒力系统 |
| 2.2.2.1 鞭毛和菌毛 |
| 2.2.2.2 胞外多糖、生物被膜、结构蛋白、磷脂 |
| 2.2.2.3 胶原酶、丝氨酸蛋白酶、烯醇化酶、脂肪酶和几丁质酶 |
| 2.2.2.4 溶血素 |
| 2.2.2.5 铁获取系统 |
| 2.2.2.6 分泌系统 |
| 2.2.2.6.1 Ⅱ型分泌系统与效应蛋白 |
| 2.2.2.6.2 Ⅲ型分泌系统与效应蛋白 |
| 2.2.2.6.3 Ⅵ型分泌系统与效应蛋白 |
| 2.2.3 毒力基因表达调控 |
| 2.3 转录组和蛋白组在细菌上的研究 |
| 2.3.1 转录组学研究进展 |
| 2.3.2 蛋白质组学研究进展 |
| 2.3.3 转录组学和蛋白质组学联合分析 |
| 第二章 团头鲂转铁蛋白基因克隆及表达分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验鱼与饲养管理 |
| 2.2 致病菌嗜水气单胞菌和铁胁迫 |
| 2.3 RNA提取和Tf cDNA克隆 |
| 2.4 Tf序列分析 |
| 2.5 Tf组织分布 |
| 2.6 在嗜水气单胞菌和铁胁迫下Tf基因在肝脏中的表达 |
| 2.7 血清铁浓度检测 |
| 2.8 铁结合实验 |
| 2.9 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 团头鲂Tf cDNA序列特征分析 |
| 3.2 团头鲂Tf同源性及发育树分析 |
| 3.3 团头鲂Tf组织分布 |
| 3.4 嗜水气单胞菌和FeCl_3注射后Tf mRNA表达分析 |
| 3.5 嗜水气单胞菌和FeCl_3注射后血清铁浓度变化 |
| 3.6 团头鲂重组Tf表达分析 |
| 3.7 团头鲂Tf铁结合能力分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 应激对团头鲂铁稳态相关基因表达及免疫指标的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验鱼与饲养管理 |
| 2.2 应激物皮质醇和LPS溶液的制备 |
| 2.3 处理与采样 |
| 2.4 测定指标与方法 |
| 2.4.1 血液生理指标测定 |
| 2.4.2 肝脏总蛋白、SOD及MDA测定 |
| 2.5 细胞实验 |
| 2.5.1 团头鲂外周血白细胞分离与培养 |
| 2.5.2 实验处理 |
| 2.5.3 WST-1法检测白细胞活率 |
| 2.5.4 检测ROS |
| 2.5.5 呼吸爆发活性的测定 |
| 2.5.6 检测Hep、Il-1、Il-6和TNF-α的表达 |
| 2.5.6.1 引物的设计与合成 |
| 2.5.6.2 cDNA的获得 |
| 2.5.6.3 SYBR Green l Real Time PCR反应 |
| 2.6 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 团头鲂血清皮质醇、血糖在不同应激胁迫下随时间变化的情况 |
| 3.2 团头鲂血清铁、肝脏铁、Tf及Hep mRNA在不同应激胁迫下随时间变化的情况 |
| 3.3 团头鲂肝脏酶SOD、MDA在不同应激胁迫下随时间变化的情况 |
| 3.4 皮质醇、DFO、LPS对团头鲂外周白细胞活性指数的影响 |
| 3.5 皮质醇、DFO、LPS对团头鲂外周白细胞ROS和呼吸爆发的影响 |
| 3.6 皮质醇、DFO、LPS添加对团头鲂外周白细胞Hep、Il-1、Il-6、TNF-α mRNA表达量的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 应激下团头鲂铁稳态的变化 |
| 4.2 应激对团头鲂免疫指标的影响 |
| 5 小结 |
| 第四章 铁限制胁迫下嗜水气单胞菌体外转录组学研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验菌株及试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 铁限制胁迫环境下嗜水气单胞菌生长曲线的测定 |
| 2.2.2 转录组样品准备 |
| 2.2.3 转录组测序分析 |
| 2.2.3.1 RNA分离及mRNA纯化 |
| 2.2.3.2 cDNA合成、Illumina测序及文库的构建 |
| 2.2.3.3 生物信息学分析 |
| 2.2.4 引物设计及RT-PCR验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 铁限制条件下嗜水气单胞菌的生长情况 |
| 3.2 铁限制条件下的差异表达基因分析 |
| 3.3 差异基因的GO富集分析 |
| 3.4 差异基因的KEGG富集分析 |
| 3.5 肠菌素的生物合成过程通路分析 |
| 3.6 差异表达基因的荧光定量验证 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 铁限制胁迫下嗜水气单胞菌体外蛋白质组学研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验操作步骤 |
| 2.2.1 蛋白提取 |
| 2.2.2 蛋白定量 |
| 2.2.3 SDS-PAGE电泳样品检测实验 |
| 2.2.4 蛋白还原烷基化及酶解 |
| 2.2.5 蛋白标记及质谱预实验 |
| 2.2.6 2D-LC-MSMS分析 |
| 2.2.6.1 反相色谱分离 |
| 2.2.6.2 反向色谱-TripleTOF分析 |
| 2.2.7 蛋白定性和定量、生物信息学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 质量检测结果 |
| 3.2 蛋白质鉴定结果统计分析 |
| 3.3 差异蛋白筛选 |
| 3.4 差异蛋白的GO富集分析 |
| 3.5 差异蛋白的KEGG富集分析 |
| 3.6 差异蛋白质网络互作图 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第六章 铁限制胁迫下嗜水气单胞菌体外转录组和蛋白质组学联合分析及酶活性的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 转录组和蛋白组数据联合分析 |
| 2.2.2 蛋白水解酶活性 |
| 2.2.3 溶血活性 |
| 2.2.4 脂肪酶活性 |
| 2.2.5 运动性 |
| 2.2.6 体内感染实验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 转录组和蛋白质组学联合分析结果 |
| 3.2 铁限制胁迫下嗜水气单胞菌的毒力基因和蛋白质聚类分析 |
| 3.3 铁含量检测 |
| 3.4 铁限制条件对嗜水气单胞菌的毒力因子的影响 |
| 3.5 感染实验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 比较转录组和蛋白质组的分析 |
| 4.2 铁限制环境下的嗜水气单胞菌的毒力评价 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的学术成果目录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 攻读学位期间发表的专利 |
| 攻读学位期间主要参与的学术会议 |
| 攻读博士学位期间获得的荣誉 |
（3）乌鳢感染A.veronii差异基因的筛选及代表性基因在体内表达规律研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1.1 乌鳢及其主要病害 |
| 1.2 鱼类抗菌相关的免疫因子 |
| 1.3 差异基因筛选技术 |
| 1.4 cDNA末端快速扩增技术(rapid amplication of cDNA ends,RACE) |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 乌鳢头肾消减cDNA文库的构建及差异基因的筛选 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 乌鳢Cu/Zn-SOD基因的克隆与表达分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 乌鳢Rac2基因的克隆与表达分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 乌鳢MPO基因的克隆与表达分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（5）凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶分离纯化与酶学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 凡纳滨对虾及虾头利用资源 |
| 1.1.1 凡纳滨对虾的特性 |
| 1.1.2 凡纳滨对虾的加工利用 |
| 1.1.3 凡纳滨对虾虾头的结构特点和生化特性 |
| 1.2 凡纳滨对虾虾头中酶的种类 |
| 1.2.1 多酚氧化酶 |
| 1.2.2 几丁质酶 |
| 1.2.3 内源性蛋白酶 |
| 1.2.4 内源性蛋白酶的分类 |
| 1.3 酶的提取及分离纯化 |
| 1.3.1 蛋白酶的分离技术 |
| 1.4 酶学特性的研究 |
| 1.4.1 影响酶活性的各种因素 |
| 1.4.2 动力学方程 |
| 1.5 蛋白质结构的研究 |
| 1.5.1 研究蛋白质结构的方法 |
| 1.5.2 蛋白质结构的鉴定 |
| 1.6 本课题的立项依据及目的意义 |
| 1.6.1 立项依据 |
| 1.6.2 目的意义 |
| 1.7 主要研究内容 |
| 2 凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶提取工艺的研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2.2 实验仪器与设备 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.4 单因素实验 |
| 2.2.5 正交实验 |
| 2.2.6 NaCl 浓度对虾头粗酶液中内源蛋白酶活力的影响 |
| 2.2.7 数据处理 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 pH 对虾头粗酶液中内源蛋白酶活力的影响 |
| 2.3.2 温度对虾头粗酶液中内源蛋白酶酶活力的影响 |
| 2.3.3 料液比对虾头内源蛋白酶酶活的影响 |
| 2.3.4 正交实验 |
| 2.3.5 NaCl 浓度对虾头内源蛋白酶活力的影响 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶的分离纯化 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料与试剂 |
| 3.2.2 实验仪器与设备 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 凡纳滨对虾虾头内源碱性蛋白酶的分离纯化 |
| 3.3.2 凡纳滨对虾虾头内源酸性蛋白酶的分离纯化 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶的酶学特性 |
| 4.1 前言 |
| 4.1.1 米氏方程 |
| 4.1.2 Km 和Vmax 的意义 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料与试剂 |
| 4.2.2 实验仪器与设备 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 凡纳滨对虾虾头内源蛋白酶酶学特性 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶结构的初步鉴定 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 主要仪器设备 |
| 5.2.3 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 pH 和离子浓度对虾头内源蛋白酶荧光光谱的测定 |
| 5.3.2 pH 和离子强度对内源蛋白酶作用的红外光谱 |
| 5.3.3 内源性蛋白酶的同源性分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 总结论 |
| 6.2 本论文的主要创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（6）大菱鲆（Schophthalmus maximus）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）免疫相关基因的克隆及其性质与功能的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1. 大菱鲆(Scophthalmus rnaximus)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)免疫相关基因 Hepcidin，Akirin 的研究进展 |
| 1.1. 鱼类抗菌肽Hepcidin |
| 1.2. A kirin 研究进展 |
| 2. 研究蛋白质相互作用的方法 |
| 2.1. 酵母双杂交技术 |
| 2.2. 免疫共沉淀技术 |
| 2.3. Pull-down 技术 |
| 2.4. 蛋白质细胞内定位 |
| 2.5. BIACORE 技术 |
| 2.6. 研究蛋白质相互作用的生物信息学方法 |
| 3. 实验选题依据以及目的意义 |
| 3.1. 选题依据 |
| 3.2. 目的意义 |
| 第二章 大菱鲆免疫相关基因 Hepcidin，及其相关基因，以及免疫调控因子Akirin 的克隆和性质研究 |
| 1. 大菱鲆抗菌肽 Sm Hepcidin 及相关蛋白的克隆及性质研究 |
| 1.1. 材料与方法 |
| 1.2. 结果 |
| 1.2.1. SmHepcidin 的克隆及序列分析 |
| 1.2.2. SmHepcidin 的启动子克隆及序列分析 |
| 1.2.3. 大菱鲆膜铁转运蛋白SmFPN1 的克隆及序列分析 |
| 1.2.4. SmFPN1 在不同组织中的表达模式分析 |
| 1.2.5. 大菱鲆转铁蛋白受体SmTFR2 的克隆及序列分析 |
| 1.2.6. Hepcidin 与铁离子之间的调控关系 |
| 1.2.7. SmHepcidin，SmFPN1 以及SmTFR2 在大菱鲆中的表达模式以及相互关系 |
| 1.2.8. Hepcidin 与NF-κB 之间的反馈调节 |
| 1.3. 讨论 |
| 2. 大菱鲆免疫相关调控因子 Sm Akiri111 的克隆及性质研究 |
| 2.1. 材料与方法 |
| 2.2. 结果 |
| 2.2.1. 大菱鲆SmAkiri111 的克隆及序列分析 |
| 2.2.2. 位于细胞核中的SmAkiri111 在酵母中的转录激活活性 |
| 2.2.3. SmAkiri111 在不同组织中的表达分析 |
| 2.3. 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 牙鲆酵母双杂交cDNA 文库的构建及免疫相关调控因子Akiri111 的克隆与性质研究 |
| 1. 牙鲆酵母双杂交cDNA 文库的构建及质量鉴定 |
| 1.1. 材料与方法 |
| 1.2. 结果 |
| 1.2.1. 牙鲆免疫器官总RNA 提取 |
| 1.2.2. 牙鲆免疫器官mRNA 分离与反转录 |
| 1.2.3. 文库质量鉴定 |
| 1.2.4. EST 测序及分析 |
| 1.3. 讨论 |
| 2. 牙鲆免疫相关调控因子 PoAkiri111 的克隆及序列分析 |
| 2.1. 材料与方法 |
| 2.2. 牙鲆PoAkiri111 的克隆及序列分析 |
| 3. 利用酵母双杂交的方法筛选与 PoAkiri111 互作的蛋白 |
| 3.1. 材料与方法 |
| 3.2. 结果 |
| 3.2.1. 文库筛选 |
| 3.2.2. HEPN |
| 3.2.3. C1q |
| 3.3. 讨论 |
| 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 博士期间发表的论文 |
（7）猪铜蓝蛋白的纯化、性质、功能及其基因克隆与表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 铜蓝蛋白的研究概况 |
| 1.2 铜蓝蛋白的结构 |
| 1.3 铜蓝蛋白的生物合成 |
| 1.4 铜蓝蛋白在机体中的分布及代谢 |
| 1.5 铜蓝蛋白的性质与特性 |
| 1.6 铜蓝蛋白的生理功能 |
| 1.6.1 铜蓝蛋白的氧化酶作用 |
| 1.6.2 铜蓝蛋白参与机体内铜的转运 |
| 1.6.3 铜蓝蛋白参与机体铁代谢 |
| 1.6.4 铜蓝蛋白与发育 |
| 1.6.5 铜蓝蛋白的抗氧化作用 |
| 1.6.6 铜蓝蛋白是急性期反应蛋白 |
| 1.6.7 铜蓝蛋白是机体铜营养状态的指示蛋白 |
| 1.6.8 铜蓝蛋白的营养作用 |
| 1.6.9 铜蓝蛋白与疾病 |
| 1.7 铜蓝蛋白的研究进展 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究的背景及意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 2.2.1 荣昌猪血清铜蓝蛋白的纯化及抑制动力学研究 |
| 2.2.2 猪铜蓝蛋白对猪脑垂体细胞分泌生长激素的影响研究 |
| 2.2.3 猪铜蓝蛋白对猪免疫功能的影响研究 |
| 2.2.4 猪铜蓝蛋白对小鼠机体抗氧化及Cu-ATP酶影响的研究 |
| 2.2.5 猪铜蓝蛋白基因的克隆、序列分析 |
| 2.2.6 铜蓝蛋白基因在荣昌猪不同生长阶段、不同组织中表达研究 |
| 2.3 研究的技术路线 |
| 第三章 猪铜蓝蛋白的纯化及其抑制动力学研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 荣昌猪铜蓝蛋白的分离纯化 |
| 3.2.2 猪铜蓝蛋白的部分性质 |
| 3.2.3 不同蛋白酶对铜蓝蛋白酶活性的影响 |
| 3.2.4 猪铜蓝蛋白最适pH值及pH稳定性 |
| 3.2.5 猪铜蓝蛋白最适温度和热稳定性 |
| 3.2.6 猪铜蓝蛋白酶促反应初速度 |
| 3.2.7 猪铜蓝蛋白酶促反应米氏常数及最大反应速度 |
| 3.2.8 效应物对猪铜蓝蛋白的影响 |
| 3.2.9 两种有机酸对猪铜蓝蛋白酶的抑制类型及抑制常数 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 猪铜蓝蛋白的分离纯化 |
| 3.3.2 猪铜蓝蛋白的性质 |
| 3.3.3 各种效应物对猪铜蓝蛋白酶活力的影响 |
| 第四章 铜蓝蛋白对猪垂体细胞分泌生长激素及免疫功能的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.1.3 数据处理 |
| 4.2 试验结果与分析 |
| 4.2.1 铜蓝蛋白对猪垂体细胞分泌生长激素的影响 |
| 4.2.2 铜蓝蛋白对猪脾细胞增殖的影响 |
| 4.2.3 铜蓝蛋白对猪T、B细胞增殖的影响 |
| 4.2.4 铜蓝蛋白对猪T淋巴细胞亚群CD_4、CD_8的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 铜蓝蛋白对仔猪垂体细胞分泌生长激素的影响 |
| 4.3.2 铜蓝蛋白对仔猪免疫功能的影响 |
| 第五章 猪铜蓝蛋白的抗氧化作用及对铜--ATP酶的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 试验结果与分析 |
| 5.2.1 铜蓝蛋白对小鼠血浆丙二醛含量的影响 |
| 5.2.2 铜蓝蛋白对小鼠肝组织总抗氧化能力的影响 |
| 5.2.3 铜蓝蛋白对小鼠肝组织中铜锌—超氧化物岐化酶的影响 |
| 5.2.4 铜蓝蛋白对小鼠肝组织中谷胱甘肽过氧化物酶的影响 |
| 5.2.5 铜蓝蛋白对小鼠肝组织中铜—ATP酶的影响 |
| 5.2.6 铜蓝蛋白对小鼠肝组织中—氧化氮的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 猪铜蓝蛋白对小鼠机体常规抗氧化指标的影响 |
| 5.3.2 猪铜蓝蛋白对小鼠体内铜--ATP酶的影响 |
| 5.3.3 猪铜蓝蛋白对小鼠体内一氧化氮含量的影响 |
| 第六章 荣昌猪铜蓝蛋白基因的克隆及序列分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料与试剂 |
| 6.1.2 试验方法与步骤 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 猪铜蓝蛋白基因的克隆 |
| 6.2.2 猪铜蓝蛋白基因的序列分析 |
| 6.2.3 猪铜蓝蛋白基因的氨基酸序列同源性比较 |
| 6.2.4 聚类分析与进化树 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 铜蓝蛋白基因在荣昌猪不同生长阶段及不同组织中表达差异的比较 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 试验材料 |
| 7.1.2 试验方法与步骤 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 RNA的提取、cDNA第一条链的合成与检测 |
| 7.2.2 实时荧光定量PCR标准曲线的建立及目的基因与内标基因溶解曲线 |
| 7.2.3 铜蓝蛋白基因在荣昌猪不同生长阶段脑、心等10种组织中表达 |
| 7.3 分析与讨论 |
| 第八章 综合与小结 |
| 论文的创新点 |
| 主要参考文献 |
| 附录Ⅰ T细胞亚群流式细胞仪检测图谱 |
| 附录Ⅱ 猪与14个其他物种铜蓝蛋白核酸序列比对图 |
| 博士在读期间发表的文章及参加的课题情况 |
| 致谢 |
（8）萍乡红鲫转铁蛋白研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 目录 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第2章 萍乡红鲫转铁蛋白电泳研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 化学药品 |
| 2.2.3 实验材料 |
| 2.2.4 样品的制备 |
| 2.2.5 电泳 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 萍乡红鲫转铁蛋白互补cDNA的克隆与分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要实验仪器 |
| 3.2.2 化学药品及试剂盒 |
| 3.2.3 质粒和菌株 |
| 3.2.4 相关软件 |
| 3.2.5 肝脏总RNA的提取 |
| 3.2.6 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)和RACE-PCR(rapid amplification of cDNA end)扩增萍乡红鲫TF-cDNA |
| 3.2.7 PCR产物的克隆和序列分析 |
| 3.2.8 蛋白质二级结构预测和同源建模 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 萍乡红鲫TF-cDNA克隆 |
| 3.3.2 萍乡红鲫TF-cDNA序列 |
| 3.3.3 萍乡红鲫TF-cDNA序列与其他脊椎动物TF序列的比较 |
| 3.3.4 萍乡红鲫TF序列与鲫鱼TF序列的比较 |
| 3.3.5 萍乡红鲫TF二级结构预测、SWISS-MODEL同源建模 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 萍乡红鲫的同源性与系统进化分析 |
| 3.4.2 萍乡红鲫TF蛋白的结构分析 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
（9）鹅GH、PRL基因序列及其多态性与早期生长发育及屠宰性状的关联分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 一、家鹅种质特性研究进展 |
| 1.1 家鹅的分类学与起源 |
| 1.2 我国的家鹅品种资源 |
| 1.3 家鹅细胞遗传学研究进展 |
| 1.4 家鹅血液蛋白多态性研究进展 |
| 1.5 家鹅分子生物学研究进展 |
| 1.6 鹅育种研究进展 |
| 二、本试验中选用的5 个鹅品种（种群）简介 |
| 三、生长激素（growth hormone,GH）及生长激素基因研究进展 |
| 3.1 生长激素及生长激素基因的结构 |
| 3.2 生长激素基因定位、表达与调控 |
| 3.3 生长激素的生理功能 |
| 3.4 GH 作用的分子机制 |
| 3.5 生长激素的生物学功能 |
| 3.6 国内外禽类生长激素基因的研究进展 |
| 四、催乳素及催乳素基因研究进展 |
| 4.1 催乳素的基本结构 |
| 4.2 催乳素的分泌调节 |
| 4.3 催乳素的生理功能 |
| 4.4 催乳素（PRL）基因结构及多态性研究进展 |
| 4.5 家禽 PRL 基因多态性研究进展 |
| 五、本研究的目的和意义 |
| 第二章 鹅早期生长发育规律的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 测定项目 |
| 1.3 统计方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 生长发育规律 |
| 3 讨论 |
| 第三章 鹅生长激素（GH）基因多态性及其与体重和屠宰性状的关联分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计分析方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 鹅 CH 基因的克隆和测序 |
| 2.2 鹅 GH 基因的多态性检测 |
| 2.3 5个鹅品种（种群）GH基因外显子SNPs等位基因的基因型和基因频率分析 |
| 2.4 5 个鹅品种（种群）GH 基因内含子 SNPs 等位基因的基因型和基因频率分析 |
| 2.5 鹅 GH 基因多态位点与早期增重和屠宰性状的关联分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 鹅 GH 基因的克隆 |
| 3.2 鹅 GH 基因编码区多态性 |
| 3.3 鹅 GH 基因内含子多态性 |
| 3.4 鹅 GH 基因多态性与体重和屠宰性能的关系 |
| 第四章 鹅催乳素（PRL）基因多态性及其与体重和屠体性状的关联分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计分析方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 鹅 PRL 基因5′端调控区的克隆和测序 |
| 2.2 鹅 PRL 基因编码区的克隆和测序 |
| 2.3 鹅 PRL 基因的多态性检测 |
| 2.4 5 个鹅品种（种群）PRL 基因SNPs 等位基因的基因型和基因频率分析 |
| 2.5 鹅 PRL 基因多态位点与早期增重和屠宰性状的关联分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 鹅 PRL 基因的克隆 |
| 3.2 鹅 PRL 基因多态性 |
| 3.3 鹅 PRL 基因多态性与体重和屠宰性能的关系 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
（10）草鱼肠道组织消减cDNA文库的构建及免疫相关基因的克隆与表达分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写名词索引 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 鱼类免疫学发展 |
| 1.1 鱼类的免疫系统 |
| 1.1.2 免疫器官和组织 |
| 1.2 免疫细胞 |
| 1.3 鱼类免疫机制 |
| 1.3.1 非特异性免疫 |
| 1.3.2 特异性免疫 |
| 2 鱼类细胞因子研究进展 |
| 2.1 鱼类白细胞介素 |
| 2.2 鱼类干扰素 |
| 2.3 Mx蛋白和干扰素调节因子 |
| 2.4 转化生长因子β |
| 2.5 肿瘤坏死因子α |
| 2.6 趋化因子 |
| 2.7 NK细胞增强因子 |
| 2.8 主要组织相容性复合体 |
| 2.9 转铁蛋白 |
| 2.10 α1-微球蛋白和Bikunin蛋白 |
| 3 本研究的意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 抑制性消减cDNA文库构建及评价 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物与菌株 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.1.4 接头和引物 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 动物材料处理 |
| 1.2.2 总RNA的提取 |
| 1.2.3 mRNA的分离纯化 |
| 1.2.4 抑制性消减杂交(SSH)文库 |
| 1.2.5 消减cDNA文库的构建与效率评价 |
| 2 结果与分析 |
| 2.2 双链cDNA合成和Rsa Ⅰ酶切效率 |
| 2.3 接头连接效率检测 |
| 2.4 消减杂交产物的2次PCR扩增结果 |
| 2.5 消减杂交效率检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 总RNA的提取和mRNA的纯化 |
| 3.2 抑制性消减杂交与文库建立 |
| 3.3 消减质量与内参基因的选择 |
| 参考文献 |
| 第三章 草鱼肠道组织消减cDNA文库的筛选及ESTs分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 主要仪器与试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 单克隆的挑选和培养 |
| 1.2.2 消减cDNA片段的初步鉴定 |
| 1.2.3 序列加工及比较分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PCR检测消减文库质量 |
| 2.2 消减cDNA EST序列的统计与分析 |
| 2.3 消减cDNA EST功能的分类 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 草鱼肠道免疫相关基因MHC Ⅱ αcDNA的克隆及序列分析 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物材料 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 引物 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 总RNA的提取 |
| 1.2.2 mRNA的分离纯化 |
| 1.2.3 SMART cDNA的合成 |
| 1.2.4 草鱼MHC Ⅱ α cDNA片段的获得 |
| 1.2.5 PCR产物的鉴定和胶回收 |
| 1.2.6 感受态细胞的制备 |
| 1.2.7 目的片断的连接和转化 |
| 1.2.8 序列分析 |
| 1.2.9 系统发育树的构建 |
| 1.2.10 MHC Ⅱα基因的RT-PCR分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RNA的提取 |
| 2.2 草鱼MHC Ⅱα基因cDNA全长及序列分析 |
| 2.2.1 草鱼MHC Ⅱα基因cDNA全长的获得 |
| 2.2.2 草鱼MHC Ⅱα氨基酸序列信号肽预测 |
| 2.2.3 草鱼MHC Ⅱα氨基酸序列的二级和三级结构预测 |
| 2.2.4 草鱼MHC Ⅱα氨基酸序列与其他物种的同源性比较 |
| 2.2.5 系统发育分析 |
| 2.3 草鱼MHC Ⅱα基因的RT-PCR分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 草鱼MHC Ⅱα基因cDNA序列的基本特征 |
| 3.2 草鱼MHC Ⅱα基因在不同组织中的表达 |
| 3.3 MHC基因与鱼类遗传育种 |
| 参考文献 |
| 第五章 草鱼免疫相关基因α1-microglobullin/bikunin precursor cDNA的克隆及序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物材料及菌种 |
| 1.1.2 引物 |
| 1.1.3 主要试剂与试剂盒 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 总RNA的提取 |
| 1.2.2 SMART cDNA的合成 |
| 1.2.3 草鱼AMBP cDNA片段的获得 |
| 1.2.4 序列分析 |
| 1.2.5 系统发育树的构建 |
| 1.2.6 草鱼AMBP基因的RT-PCR分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 AMBP基因cDNA的克隆及序列分析 |
| 2.2 草鱼AMBP二级结构和三级结构的预测 |
| 2.3 草鱼AMBP氨基酸序列的同源性比较与系统进化分析 |
| 2.4 草鱼AMBP基因在组织中的表达分布 |
| 3 讨论 |
| 3.1 草鱼AMBP基因cDNA序列分析 |
| 3.2 草鱼AMBP基因在不同组织中的表达 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 博士在读期间的学术成果 |
| 附录1 测序图谱 |
| 附录2 GenBank接受序列 |
四、鲫血清转铁蛋白推导序列分析及空间结构预测（论文参考文献）
- [1]利用铁蛋白基因融合表达猪瘟病毒E2囊膜蛋白[D]. 魏珍珍. 江苏科技大学, 2020(03)
- [2]团头鲂铁稳态调控及其对嗜水气单胞菌毒力的影响研究[D]. 滕涛. 南京农业大学, 2018(07)
- [3]乌鳢感染A.veronii差异基因的筛选及代表性基因在体内表达规律研究[D]. 单晓枫. 吉林农业大学, 2013(11)
- [4]鸡蛋卵转铁蛋白过敏原B细胞线性表位的预测研究[J]. 佟平,高金燕,陈红兵,李欣,简姗,张银. 食品科学, 2011(17)
- [5]凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶分离纯化与酶学特性研究[D]. 庄志凯. 广东海洋大学, 2011(06)
- [6]大菱鲆（Schophthalmus maximus）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）免疫相关基因的克隆及其性质与功能的研究[D]. 杨长庚. 中国海洋大学, 2011(02)
- [7]猪铜蓝蛋白的纯化、性质、功能及其基因克隆与表达研究[D]. 李前勇. 西南大学, 2010(08)
- [8]萍乡红鲫转铁蛋白研究[D]. 甘云飞. 南昌大学, 2008(05)
- [9]鹅GH、PRL基因序列及其多态性与早期生长发育及屠宰性状的关联分析[D]. 赵文明. 扬州大学, 2008(01)
- [10]草鱼肠道组织消减cDNA文库的构建及免疫相关基因的克隆与表达分析[D]. 苏建明. 湖南农业大学, 2007(07)