一、外源精氨酸摄入对移植瘤生长的抑制作用（论文文献综述）
渠宏雁[1]（2021）在《抑制脂肪酸合成酶对高脂和高糖膳食诱导的肥胖血糖水平、氧化稳态和代谢的影响》文中指出肥胖已成为威胁人类健康的主要因素之一,通常认为,导致大多数肥胖的重要原因是摄入过量的高能量饮食。而体重超重和葡萄糖耐量减低则是饮食诱导的肥胖的两个关键特征。摄入膳食脂肪不仅可以通过不同的分子途径来实现对脂质代谢相关基因的表达调控,还能影响食欲相关激素的信号传导。另外,这些参与脂质代谢的分子途径还与慢性炎症和胰岛素抵抗有关。但高糖饮食在代谢综合征研究方面的应用则较为少见。作为机体中由糖合成脂肪所必经的酶,脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FASN）参与脂肪酸从头合成,是该过程的关键酶类,可作为突破点研究高糖和高脂膳食对肥胖小鼠的不同影响。本课题分别以高糖和高脂饲料饲喂小鼠,以研究膳食能量密度恒定时精制糖和脂肪为主要供能物质时所引起的肥胖在表型、血糖水平、氧化应激和代谢等方面的异同,以期为通过改善膳食结构来辅助调控肥胖及其相关代谢综合征提供另一种思路和可能。本文的主要研究结果如下:（1）高糖和高脂膳食均能诱导小鼠出现肥胖表型,但高脂膳食和高糖膳食诱导的肥胖小鼠在体重和血糖紊乱进程、肠道微生物区系三方面都有明显差异。以C57BL/6J小鼠为实验对象,分别饲喂精制糖和脂肪供能占比不同但能量密度一致的饲料11周,各组小鼠均出现了肥胖和血糖紊乱的症状,但饲喂6周时高脂组（High fat diet,HFD）就已超重20%,且其空腹血糖和对照组（Negtive control,NC）存在明显差异,而中度糖脂组（Middle fat and sucrose diet,MFSD）和高糖组（High sugar diet,HSD）仅糖耐量明显下降。此外,HFD和HSD还分别诱导了糖尿病前期小鼠肥胖相关肠道微生物区系的不同模式。（2）构建脂肪代谢抑制系统,筛选脂肪酸合成酶抑制剂。在这项研究中,我们通过基于结构的虚拟筛选得到一种可在KR-domain（β-酮脂酰ACP还原酶结构域,β-ketoacyl ACP reductase,KR）和FASN结合的新型小分子抑制剂前体PFI09。其化学性质稳定的结构改性物MFI03可抑制FASN活性,减少前列腺癌细胞PC3在体外和体内的增殖,影响细胞脂肪酸组成,抑制胞内脂质蓄积,诱导细胞凋亡。因此,MFI03是有效的FASN抑制剂,具有抗肿瘤增殖和抗脂质生成的能力。（3）FASN小分子抑制剂可干预高糖膳食诱导的肥胖小鼠炎症和氧化稳态。FASN作为机体内从糖合成脂质必经的酶,当其功能受到抑制时,HFD组和HSD组小鼠受到的影响不同,且以HSD组所受影响最为明显。腹腔注射浅蓝菌素和MFI03的HSD诱导的肥胖鼠不仅体重和脂肪质量明显低于HSD对照组,其肝脏质量、炎症水平和氧化程度与HSD对照组相比也得到了明显改善。（4）FASN小分子抑制剂可干预高糖膳食诱导的肥胖小鼠代谢紊乱。抑制FASN活性可抑制内源性脂肪酸的合成,进而减少HSD组小鼠肝脏中总脂含量和甘油三酯（Triglyceride,TG）水平,而对HFD组无明显影响。非靶向代谢组分析结果也表明抑制FASN可通过甘油磷脂代谢、丙酸代谢、组氨酸代谢等多种代谢通路调控高脂膳食诱导的肥胖小鼠肝脏代谢紊乱。综上所述,本研究筛选得到了稳定且有效的新型FASN小分子抑制剂,并发现抑制FASN活性可以有效改善高糖膳食导致的肥胖和代谢紊乱。这为通过改善膳食结构辅助调控肥胖及其相关代谢综合征提供了理论依据。
王传玲[2]（2021）在《H3R117单ADP核糖基化调节IGFBP1甲基化影响大肠癌脂代谢机制研究》文中认为背景及目的大肠癌是世界重大公共健康问题,发病率居高不下。虽然目前已有手术、化疗、靶向治疗等方法,但治疗效果有限,大肠癌的死亡率仍然排名靠前,因此寻求新的治疗靶点迫在眉睫。随着研究进展,大肠癌表观遗传学改变受到关注。单ADP核糖基化是表观遗传的一种,但在大肠癌中的修饰水平及修饰靶蛋白尚不明确。本研究小组前期研究表明,催化单ADP核糖基化修饰催化酶ARTD8和ARTD14在大肠癌中表达较对照大肠组织显着增加,并且两者在大肠癌细胞胞核中都有表达,提示大肠癌细胞核内存在异常的单ADP核糖基化修饰;对大肠癌细胞系组蛋白单ADP核糖基化修饰进行高效液相串联质谱分析,发现LoVo细胞组蛋白H3第117位精氨酸（H3R117）存在单ADP核糖基化修饰;该位点修饰能抑制细胞凋亡,促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等;在改变了H3第117位精氨酸单ADP核糖基化状态的LoVo细胞转录组分析中,发现其固醇调节元件结合转录因子1（SREBP1）和脂肪酸合成酶（FASN）基因表达降低,与脂代谢密切相关。越来越多的证据表明脂代谢紊乱与大肠癌有一定关系,可能在早期就参与大肠癌的发展,但具体机制还不明确。IGFBP1是调控IGF-1发挥作用的分子开关,且IGFBP1在大肠癌中水平较低。课题组前期研究结果亦显示,H3R117单ADP核糖基化修饰可调节DNA甲基化和组蛋白修饰,抑制抑癌基因表达,但是否影响IGFBP1甲基化还不清楚。本研究将在前期研究基础上,分析大肠癌细胞核单ADP核糖基化修饰水平,探索LoVo细胞H3R117单ADP核糖基化修饰是否调节IGFBP1启动子甲基化并影响细胞脂代谢,在大肠癌凋亡中发挥作用,为寻找大肠癌治疗潜在靶点提供新的思路及实验依据。方法本研究分为三部分:1、结直肠癌细胞核单ADP核糖基化水平的分析采用免疫组化方法检测64例大肠癌和对照大肠组织细胞核单ADP核糖基化修饰水平,并分析其与临床病理特征的关系。2、H3 R117单ADP核糖基化经IGFBP1对LoVo细胞脂代谢及凋亡的影响（1）H3 R117单ADP核糖基化对LoVo细胞脂代谢影响实验分为四组:选用课题组前期已成功构建的H3R117单ADP核糖基化修饰位点突变的大肠癌LoVo细胞（将组蛋白H3第117位精氨酸突变为丙氨酸和赖氨酸）为实验对象:突变组1（Mut-1）,即H3R117位点精氨酸突变为丙氨酸LoVo细胞,突变组2（Mut-2）,即H3R117位点精氨酸突变为赖氨酸LoVo细胞,观察H3R117单ADP核糖基化修饰的作用。空载组（empty vector）即转染空载体LoVo细胞和未经处理LoVo细胞（control）作为对照。1)ELISA检测细胞胆固醇和脂肪酸含量。2)ELISA检测细胞培养上清液IGF-1水平。3)Western Blot检测细胞IGFBP1、IGF-1R和SREBP1的表达水平。4)q RT-PCR检测细胞ACC、ACLY、FASN和HMGCR mRNA表达水平。（2）H3 R117单ADP核糖基化经IGFBP1对LoVo细胞凋亡影响采用小干扰RNA敲低IGFBP1基因。实验分为六组:未经处理LoVo细胞（control）;空载组（empty vector）;突变组1（Mut-1）,即H3R117位点精氨酸突变为丙氨酸LoVo细胞;突变组2（Mut-2）即H3R117位点精氨酸突变为赖氨酸LoVo细胞;突变组1+si-IGFBP1（Mut-1+si-IGFBP1）,即H3R117位点精氨酸突变为丙氨酸同时敲低IGFBP1基因LoVo细胞;突变组2+si-IGFBP1（Mut-2+si-IGFBP1）,即H3R117位点精氨酸突变为赖氨酸同时敲低IGFBP1基因LoVo细胞。1)在敲低IGFBP1后,采用ELISA检测LoVo细胞培养上清液IGF-1总体水平,采用Western Blot检测LoVo细胞IGFBP1的蛋白表达水平,采用q RT-PCR检测LoVo细胞IGF-1R、SREBP1、ACC、FASN和HMGCR mRNA表达水平。2)拉曼共聚焦显微镜检测敲低IGFBP1对细胞胆固醇的影响。3)Western Blot检测敲低IGFBP1对细胞膜脂筏、胞核和胞质IGF-1R表达的影响。4)Western Blot检测敲低IGFBP1对细胞Caspase3表达的影响;流式细胞术检测细胞凋亡率。5)H3 R117单ADP核糖基化对移植瘤IGFBP1、IGF-1R、SREBP1和Caspase3表达的影响A.建立裸鼠皮下移植瘤模型,实验分为四组:未经处理LoVo细胞（control）,空载组（empty vector）,突变组1（Mut-1）即H3R117位点精氨酸突变为丙氨酸LoVo细胞,突变组2（Mut-2）即H3R117位点精氨酸突变为赖氨酸LoVo细胞。B.测量移植瘤瘤体最大径a和最小径b,按照V=ab2/2（cm3）计算皮下移植瘤体积。C.提取移植瘤组织蛋白,采用Western Bolt检测移植瘤组织IGFBP1、IGF-1R、SREBP1和Caspase3的表达。3、H3 R117单ADP核糖基化经IGFBP1影响LoVo细胞脂代谢及凋亡的机制研究（1）H3 R117单ADP核糖基化对IGFBP1启动子甲基化的影响实验分为四组:未经处理LoVo细胞（control）,空载组（empty vector）,突变组1（Mut-1）即H3R117位点精氨酸突变为丙氨酸LoVo细胞,突变组2（Mut-2）即H3R117位点精氨酸突变为赖氨酸LoVo细胞。1)采用Disease Meth version 2.0数据库分析大肠癌和对照大肠组织IGFBP1启动子甲基化水平。2)重亚硫酸盐测序法检测四组细胞IGFBP1启动子甲基化水平。3)ChIP检测H3R117单ADP核糖基化对IGFBP1基因启动子H3K9me2/3水平以及HP1α和DNMT1富集的影响。4)Western Bolt检测H3R117单ADP核糖基化对组蛋白瓜氨酸化H3cit表达的影响。5)Ch IP检测H3R117单ADP核糖基化对IGFBP1基因启动子H3cit水平的影响。（2）H3 R117单ADP核糖基化经H3cit对IGFBP1启动子甲基化的影响采用抑制剂Cl-amidine抑制组蛋白瓜氨酸化。实验分为六组:未经处理LoVo细胞（control）;空载组（empty vector）;突变组1（Mut-1）即H3R117位点精氨酸突变为丙氨酸LoVo细胞;突变组2（Mut-2）即H3R117位点精氨酸突变为赖氨酸LoVo细胞;突变组1+Cl-amidine（Mut-1+Cl-amidine）,即H3R117位点精氨酸突变为丙氨酸LoVo细胞同时加入抑制剂Cl-amidine;突变组2+Cl-amidine（Mut-2+Cl-amidine）,即H3R117位点精氨酸突变为赖氨酸LoVo细胞同时加入抑制剂Cl-amidine。1)CCK-8方法选取抑制剂Cl-amidine作用细胞的时间和浓度;Western Blot检测抑制剂Cl-amidine对H3cit和IGFBP1蛋白表达的影响。2)激光共聚焦显微镜观察加入抑制剂Cl-amidine后HP1α和DNMT1的共定位。3)甲基化DNA免疫共沉淀-实时定量PCR法检测加入抑制剂Cl-amidine对IGFBP1启动子甲基化水平的影响。结果1.结直肠癌细胞核单ADP核糖基化水平的分析（1）免疫组化结果显示,单ADP核糖基化在大肠癌和对照大肠组织中均有阳性染色,在大肠癌中的水平较对照大肠组织显着增加（p<0.05）,在细胞核中表达亦较对照大肠组织增加（p<0.05）。（2）对大肠癌的临床病理特征进行分析,结果显示,随着肿瘤浸润深度和肿瘤分级的增加,大肠癌细胞核中单ADP核糖基化水平逐渐增加,细胞核中单ADP核糖基化水平与浸润深度成正相关（p<0.05）,与肿瘤分级成正相关（p<0.05）,与性别、年龄、肿瘤位置、淋巴结转移和TNM分期无关（p>0.05）。2.H3 R117单ADP核糖基化经IGFBP1对LoVo细胞脂代谢及凋亡的影响（1）H3 R117单ADP核糖基化对LoVo细胞脂代谢影响1)ELISA检测细胞胆固醇和脂肪酸含量,结果显示,与对照组和空载组比较,突变1组和突变2组细胞的脂肪酸和胆固醇含量显着减少（p<0.05）。对照组和空载组比较、突变1组和突变2组比较均无统计学差异（p>0.05）。2)ELISA检测细胞培养上清液IGF-1水平,结果显示,与对照组和空载组比较,突变1组和突变2组细胞培养上清液IGF-1水平显着减少（p<0.05）。对照组和空载组比较、突变1组和突变2组比较均无统计学差异（p>0.05）。3)Western Blot检测细胞IGFBP1、IGF-1R和SREBP1的表达水平,结果显示,与对照组和空载组比较,突变1组和突变2组IGFBP1蛋白表达增加,IGF-1R、SREBP1蛋白表达降低（p<0.05）。对照组和空载组比较、突变1组和突变2组比较均无统计学差异（p>0.05）。4)qRT-PCR检测LoVo细胞脂肪酸和胆固醇合成限速酶ACLY、FASN、ACC和HMGCR的表达,结果显示,与对照组和空载组比较,突变1组和突变2组ACC、FASN和HMGCR mRNA表达降低（p<0.05）,ACLY无差异（p>0.05）。对照组和空载组比较、突变1组和突变2组比较均无统计学差异（p>0.05）。（2）H3 R117单ADP核糖基化经IGFBP1对LoVo细胞凋亡影响1)采用小干扰RNA敲低IGFBP1基因,选取si-IGFBP1-2为最优序列。ELISA检测敲低IGFBP1后细胞培养上清液IGF-1水平,结果显示,与突变1组和突变2组相比,突变1组+si-IGFBP1和突变2组+si-IGFBP1的细胞培养上清液IGF-1水平显着增加（p<0.05）。对照组和空载组间、突变1组和突变2组、突变1组+si-IGFBP1和突变2组+si-IGFBP1比较均无统计学差异（p>0.05）。2)Western Blot检测敲低IGFBP1后LoVo细胞IGFBP1的蛋白表达水平,结果显示,与突变1组和突变2组相比,突变1组+si-IGFBP1和突变2组+si-IGFBP1 IGFBP1蛋白表达降低（p<0.05）。对照组和空载组间、突变1组和突变2组、突变1组+si-IGFBP1和突变2组+si-IGFBP1比较均无统计学差异（p>0.05）。3)qRT-PCR检测敲低IGFBP1后细胞IGF-1R、SREBP1、ACC、FASN和HMGCR mRNA表达水平,结果显示,与突变1组和突变2组相比,突变1组+si-IGFBP1和突变2组+si-IGFBP1的IGF-1R、SREBP1、ACC、FASN和HMGCR的mRNA表达显着增加（p<0.05）。对照组和空载组比较、突变1组和突变2组、突变1组+si-IGFBP1和突变2组+si-IGFBP1比较均无统计学差异（p>0.05）。4)拉曼共聚焦显微镜检测敲低IGFBP1对细胞胆固醇的影响,结果显示,胆固醇标准品特征峰在1439cm-1处;与突变1组和突变2组相比,突变1组+si-IGFBP1和突变2组+si-IGFBP1的拉曼强度均显着增加（p<0.05）,细胞胆固醇含量增加。对照组和空载组间、突变1组和突变2组间、突变1+si-IGFBP1组和突变2+si-IGFBP1组间的拉曼强度没有统计学差异（p>0.05）。5)Western Blot检测敲低IGFBP1对细胞膜脂筏、胞核和胞质IGF-1R表达的影响,结果显示,与突变1组和突变2组相比,敲低IGFBP1后突变的两组细胞脂筏、细胞核和细胞质的IGF-1R均显着增加（p<0.05）。6)Western Blot检测敲低IGFBP1对细胞Caspase3表达的影响,结果显示,与突变1组和突变2组相比,突变1组+si-IGFBP1和突变2组+si-IGFBP1的Caspase3裂解减少（p<0.05）;敲低IGFBP1后,流式细胞术检测LoVo细胞的凋亡率,结果显示,与突变1组和突变2组相比,突变1组+si-IGFBP1和突变2组+si-IGFBP1的细胞凋亡率下降（p<0.05）。对照组和空载组间、突变1组和突变2组间、突变1+si-IGFBP1组和突变2+si-IGFBP1组间比较无统计学差异（p>0.05）。7)裸鼠皮下移植瘤构建成功,计算皮下移植瘤体积,结果显示,与对照组和空载组相比,突变1组和突变2组的皮下移植瘤体积显着减小（p<0.05）。Western Blot检测结果显示,与对照组和空载组相比,突变1组和突变2组的IGFBP1表达增加,IGF-1R和SREBP1蛋白表达降低,Caspase3裂解增加（p<0.05）。对照组和空载组间、突变1组和突变2组间比较无统计学差异（p>0.05）。3.H3 R117单ADP核糖基化经IGFBP1影响LoVo细胞脂代谢及凋亡的机制研究（1）H3 R117单ADP核糖基化对IGFBP1启动子甲基化的影响1)生物信息学分析大肠癌和对照大肠组织IGFBP1启动子甲基化水平,结果显示,大肠癌组织IGFBP1启动子甲基化水平较对照大肠组织显着增加（p<0.05）。2)重亚硫酸盐测序法检测IGFBP1启动子甲基化水平,结果显示,突变1组和突变2组细胞IGFBP1启动子甲基化水平较对照组和空载组显着降低（p<0.05）。对照和空载组、突变1组和突变2组之间无统计学意义（p>0.05）。3)Ch IP检测H3R117单ADP核糖基化对IGFBP1基因启动子H3K9me2/3水平以及HP1α和DNMT1富集的影响,结果显示,与对照组和空载组比较,突变1组和突变2组细胞IGFBP1启动子片断上H3K9me2修饰水平、HP1α和DNMT1的富集显着降低（p<0.05）,H3K9me3修饰水平无统计学差异（p>0.05）。对照和空载比较、突变1组和突变2组比较均无统计学意义（p>0.05）。4)Western Bolt检测H3R117单ADP核糖基化对组蛋白H3cit表达的影响,结果显示,与对照和空载组比较,突变1组和突变2组的H3cit表达显着增加（p<0.05）。对照和空载比较、突变1组和突变2组比较均无统计学意义（p>0.05）。5)ChIP检测H3R117单ADP核糖基化对IGFBP1基因启动子H3cit水平的影响,结果显示,与对照组和空载组比较,突变1组和突变2组细胞IGFBP1启动子片断上有更多的H3cit修饰（p<0.05）。对照和空载比较、突变1组和突变2组比较均无统计学意义（p>0.05）。（2）H3 R117单ADP核糖基化经H3cit对IGFBP1启动子甲基化的影响1)选取瓜氨酸化抑制剂Cl-amidine作用浓度200μM,作用时间48 h。Western Blot检测抑制剂Cl-amidine对H3cit和IGFBP1蛋白表达的影响,结果显示,与突变1组和突变2组相比,加入Cl-amidine后两组的H3cit和IGFBP1蛋白表达显着降低（p<0.05）。对照和空载组间、突变1组和突变2组间、突变1+Cl-amidine组和突变2+Cl-amidine组间均无统计学差异（p>0.05）。2)激光共聚焦显微镜观察加入抑制剂Cl-amidine后HP1α和DNMT1的共定位,结果显示,绿色荧光HP1α和红色荧光DNMT1共定位显示为橘黄色荧光,与未加Cl-amidine时相比,突变的两组细胞加入Cl-amidine后与HP1α共定位的DNMT1均增加。3)甲基化DNA免疫共沉淀-实时定量PCR法检测加入抑制剂Cl-amidine对IGFBP1启动子甲基化水平的影响,结果显示,与未加Cl-amidine时相比,突变的两组细胞加入Cl-amidine后IGFBP1启动子5m C的富集显着增加（p<0.05）,IGFBP1启动子甲基化水平增加。对照和空载组之间、突变1组和突变2组之间、突变1+Cl-amidine组和突变2+Cl-amidine组之间没有差别（p>0.05）。结论1.大肠癌细胞核内存在的单ADP核糖基化修饰与肿瘤侵袭深度和分级呈正相关,随着肿瘤细胞核内单ADP核糖基化修饰水平的增加,肿瘤浸润深度越深,分级越高。提示单ADP核糖基化修饰参与大肠癌的进展。2.大肠癌细胞组蛋白H3R117单ADP核糖基化修饰可上调IGFBP1启动子甲基化水平,并与启动子片段上H3cit修饰水平降低、H3K9me2修饰水平增加、以及HP1α和DNMT1的富集增加有关。大肠癌IGFBP1基因启动子的甲基化水平增加,可增加大肠癌胆固醇合成,抑制细胞凋亡,从而在大肠癌发展过程中发挥促进作用。本研究丰富了大肠癌表观遗传学的内容,为H3R117单ADP核糖基化修饰成为大肠癌的靶点提供了新的思路及一定的实验依据。
吴皎[3]（2021）在《肠内营养中胱/半胱氨酸促进结肠癌生长和耐药的功能和机制研究》文中提出[目 的]体重下降、恶病质和营养不良是结直肠癌（CRC）患者的常见问题,其营养不良发生率高达39.3%,所以肠内肠外营养（PEN）支持在此类癌症患者的营养支持中起着非常重要的作用。然而,目前关于营养制剂中的非必需氨基酸成份对癌症发生发展的影响尚未得到充分研究,因此本课题拟研究营养制剂中的非必需氨基酸成份对消化道肿瘤患者生存预后的影响,筛查出影响患者预后的关键氨基酸,并深入探讨其功能和解析内在机制,以期优化CRC患者营养支持的配方。[方 法]为了筛查影响患者生存预后的关键氨基酸成份,课题组在MD Anderson癌症中心回顾性分析了 2008年至2013年间接受肠胃外营养（PN）支持的消化道肿瘤患者的病历信息（n=1378）,初步筛查出胱/半胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸成份与患者较差生存预后相关,并通过系列体内外实验验证表明胱/半胱氨酸在促进CRC的功能中具有独特和重要的作用。本课题首先通过体外SRB染色和体内异种移植瘤实验,测试了胱氨酸成份对细胞存活、药物敏感性和肿瘤生长的影响;然后,本课题采用流式细胞仪和EdU实验分析了胱氨酸对细胞周期分布、细胞凋亡和DNA合成的影响。接着,本课题通过RNA-seq、WB、qRT-PCR和检测ROS/GSH水平等阐明了胱/半胱氨酸促进结肠癌生长和耐药的机制,并采用小分子抑制剂和siRNAs进行了相关回复实验。最后,本课题采用缺乏不同氨基酸的条件培养基,通过检测细胞存活和细胞凋亡情况,对比了胱氨酸与其它几种非必需氨基酸的在CRC生长和耐药中的作用。[结 果]本研究第一部分的研究结果发现:接受了添加半胱氨酸PN制剂的消化道肿瘤病人,其总生存期较未添加者显着缩短（P<0.001）;胱氨酸在体外实验和免疫缺陷小鼠中均明显地促进了结肠癌的生长,促进了结肠癌细胞周期进程和DNA合成;重要的是,胱氨酸剥夺饮食可以显着抑制结肠癌移植瘤的生长,但不影响小鼠体重的正常增长。本研究第二、三部分的研究结果解析了胱氨酸促进结肠癌生长的机制:其机制主要是通过抑制GCN2-ATF4轴信号转导进而抑制SESN2的转录,最终导致mTORC1激活而促进了结肠癌的生长;敲低mTOR或者用mTORC1抑制剂雷帕霉素、依维莫司均可以阻断胱氨酸介导的促结肠癌细胞生长作用。本研究第四部分的研究结果表明:胱氨酸会诱导结肠癌细胞对奥沙利铂和伊立替康发生耐药,其机制主要是胱氨酸通过合成谷胱甘肽帮助清除化疗诱导产生的活性氧,从而保护细胞免于化疗诱导的凋亡导致化疗抵抗;胱氨酸剥夺饮食显着增加了结肠癌移植瘤对奥沙利铂的敏感性。最后,本研究还比较了胱氨酸和其它几种非必需氨基酸包括亮氨酸、赖氨酸或精氨酸在结肠癌中的作用。与氨基酸完全培养基（AAs+）培养基相比,剥夺其中任何一个氨基酸都会降低细胞存活,但剥夺胱氨酸或精氨酸对结肠癌细胞存活的抑制作用最为最为显着。然而,在奥沙利铂治疗下,仅有胱氨酸的剥夺显着增加了结肠癌细胞对化疗的敏感性,剥夺胱氨酸而非亮氨酸、赖氨酸或精氨酸使奥沙利铂介导的细胞生长抑制作用和细胞凋亡可被进一步增加,提示胱氨酸在CRC中具有更为重要和独特的作用,营养制剂中添加胱氨酸成份导致CRC患者较差预后。[结 论]我们的研究结果表明肠内外营养制剂中的胱/半胱氨酸成份在结直肠癌的发生发展中起着重要作用,限制营养制剂中的胱/半胱氨酸含量或可改善结肠直肠癌患者的生存预后。
钟国超[4]（2021）在《GTP环化水解酶1在肝癌细胞增殖中的作用及机制研究》文中指出第一部分GTP环化水解酶1（GCH1）在肝细胞癌组织和肝癌细胞中的表达及其临床意义背景和目的:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是原发性肝癌的主要病理类型。代谢重编程是包括肝癌细胞在内所有肿瘤细胞的特征之一。积极寻找HCC的代谢调节因子,对于深入理解代谢重编程在其发生发展中的作用具有重要意义。GTP环化水解酶1（GTP cyclohydrolase 1,GCH1）是四氢生物喋呤（tetrahydrobiopterin,BH4）从头合成途径的限速酶。本部分拟探讨GCH1在肝细胞癌组织和肝癌细胞中的表达及其临床意义。方法:（1）我们使用RT-qPCR和Western blotting检测肝细胞癌组织和配对癌旁组织以及永生化肝细胞MIHA和肝癌细胞中GCH1的表达水平。同时,我们使用甲基化特异性PCR评估GCH1启动子区的甲基化状态。（2）基于组织芯片,我们在两个独立的队列中分析GCH1表达水平和HCC患者临床病理特征、总生存率和无复发生存率的关系,并利用单因素和多因素Cox比例风险回归模型探讨GCH1表达水平与总生存率和无复发生存率之间的关系。结果:（1）与癌旁组织或永生化肝细胞MIHA相比,GCH1在肝细胞癌组织或肝癌细胞中普遍低表达。甲基化特异性PCR显示:GCH1在HCC中的低表达是由于启动子区甲基化造成的。（2）在重庆队列中,GCH1表达水平与性别（P=0.02）,巴塞罗那临床肝癌分期（P<0.01）、肿瘤大小（P<0.01）和肿瘤数目（P=0.02）显着相关;在四川队列中,GCH1表达水平与甲胎蛋白水平（P=0.01）、ALT水平（P=0.02）、肿瘤大小（P=0.02）和肿瘤数目（P=0.02）显着相关。在重庆和四川队列中,Kaplan-Meier生存曲线显示:GCH1低表达组HCC患者的总生存率（P<0.01）和无复发生存率（P<0.01）显着低于GCH1高表达组;同时,多因素Cox回归提示:GCH1表达水平是HCC患者总死亡率和无复发死亡率的独立预测因素（P<0.05）。结论:GCH1由于启动子区甲基化在肝细胞癌组织和肝癌细胞中普遍低表达;GCH1低表达是HCC患者不良预后的预测因子。第二部分GCH1沉默促进肝癌细胞的增殖背景和目的:既往研究发现:GCH1能够促进小鼠黑色素瘤细胞和人乳腺癌细胞的增殖以及人胶质母细胞瘤的生长。本部分拟探讨GCH1表达水平的改变对肝癌细胞的增殖、迁移和诱导血管发生等表型的影响。方法:（1）我们使用CCK-8实验、平板克隆形成实验和EdU实验以及HCC皮下移植瘤模型评估GCH1表达水平的改变对肝癌细胞增殖的影响。（2）我们使用划痕实验评估GCH1表达水平改变对肝癌细胞迁移能力的影响。（3）我们使用人脐静脉内皮细胞脉管形成实验评估GCH1表达水平改变对肝癌细胞诱导血管形成能力的影响。（4）我们使用流式细胞术检测GCH1表达水平改变对细胞周期和细胞凋亡的影响。（5）我们使用Western blotting检测GCH1表达水平改变对cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2表达水平的影响。结果:（1）CCK-8实验、平板克隆形成实验和EdU实验显示:GCH1过表达会显着抑制肝癌细胞的生长活力（P<0.05）和抑制肝癌细胞的增殖能力（P<0.05）,而GCH1沉默则具有相反的效应。同时,裸鼠皮下成瘤实验显示:GCH1沉默组的移植瘤重量（P<0.05）和体积（P<0.05）显着高于对照组。（2）流式细胞术显示:GCH1过表达会促进细胞凋亡（P<0.05）,而GCH1沉默则会抑制细胞凋亡（P<0.05）;Western blotting实验显示:GCH1过表达会促进cleaved caspae-3和Bax的表达、抑制Bcl-2的表达;GCH1沉默则具有相反的效应。（3）划痕实验显示:GCH1表达水平改变对肝癌细胞迁移能力无显着影响（P>0.05）;同时,人脐静脉内皮细胞脉管形成实验显示:GCH1表达水平改变对肝癌细胞诱导血管形成的能力无显着影响（P>0.05）。结论:GCH1低表达会显着地促进肝癌细胞的增殖,而对肝癌细胞的迁移能力和诱导血管形成能力无显着影响。第三部分GCH1沉默的促增殖效应是BH4合成减少的直接结果背景和目的:GCH1是BH4从头合成途径的限速酶,催化GTP转化为二氢新蝶呤三磷酸盐。本部分的研究目的是明确GCH1在HCC中的生物学功能是否依赖于其催化产物BH4。方法:（1）我们使用BH4酶联免疫分析试剂盒检测GCH1过表达和沉默之后细胞内BH4水平的变化。（2）我们通过CCK-8实验和HCC皮下移植瘤模型明确外源性BH4对肝癌细胞增殖的影响以及BH4合成减少是否介导了GCH1沉默的促增殖效应。结果:（1）GCH1过表达之后,细胞内BH4水平显着上升（P<0.05）;而GCH1沉默之后,细胞内BH4水平显着下降（P<0.05）。（2）CCK-8实验显示:BH4在体外能够显着抑制肝癌细胞的增殖;同时,裸鼠皮下移植瘤实验显示:BH4处理组的裸鼠皮下瘤的体积和重量显着低于对照组裸鼠皮下瘤的体积和重量。（3）回复实验显示:外源性BH4能够逆转GCH1沉默的所带来的促增殖效应。结论:BH4在体内外对肝癌细胞的生长均具有抑制效应;BH4从头合成的减少介导了GCH1沉默在HCC中的促增殖效应。第四部分GCH1沉默通过激活ASK1/p38信号来促进肝癌细胞的增殖背景和目的:第1-3部分的实验发现:GCH1沉默会促进肝癌细胞的增殖。本部分拟探讨GCH1沉默促进肝癌细胞增殖的分子机制。方法:（1）我们使用Western blotting来筛选常见的肿瘤信号通路,并进一步通过RT-qPCR来检测下游基因的mRNA表达水平的变化。（2）我们使用SB203580和si RNA进行回复实验以明确p38信号是否介导了GCH1沉默所带来的促增殖效应。（3）我们使用Western blotting检测ASK1磷酸化水平的改变,并使用ASK1信号的抑制剂selonsertib来明确ASK1信号是否是p38信号的上游。结果:（1）Western blotting实验发现:GCH1沉默激活了p38信号;同时,RT-qPCR实验发现:GCH1沉默之后,p38信号正向调节的下游基因的mRNA表达水平显着上调。（2）SB203580抑制了p38信号的激活,并且逆转了GCH1沉默所带来的促增殖效应。（2）RNAi实验发现:沉默p38α或p38γ会抑制肝癌细胞的增殖;同时沉默p38α和p38γ会逆转GCH1沉默所带来的促增殖效应。（3）Western blotting实验发现:GCH1沉默上调了ASK1的磷酸化水平;在使用selonsertib抑制ASK1信号后,p38信号也受到显着抑制。结论:GCH1沉默通过激活ASK1/p38信号通路来促进肝癌细胞的增殖。第五部分O2·-的增加是GCH1沉默激活ASK1/p38信号通路的中间环节背景和目的:上述实验表明:GCH1沉默通过激活ASK1/p38信号通路来促进肝癌细胞的增殖。本部分拟探讨GCH1沉默是如何激活ASK1/p38信号通路的。方法:（1）我们使用Western blotting来检测BH4对ASK1/p38信号通路的影响。（2）我们使用DHE荧光探针检测BH4对细胞内O2·-水平的影响。（3）我们使用氧自由基清除剂NAC来进行回复实验,以明确O2·-水平的增加是否介导了GCH1沉默所致的ASK1/p38信号的激活。结果:（1）Western blotting实验发现:BH4以剂量依赖的方式抑制了ASK1/p38信号通路的激活。（2）GCH1沉默会通过抑制BH4的从头合成来上调细胞内O2·-水平。（3）回复实验显示:O2·-水平的增加介导了GCH1沉默所致的ASK1/p38信号通路的激活。结论:GCH1沉默通过促进细胞内O2·-的产生来激活ASK1/p38信号通路。
戴小军[5]（2020）在《运化毒邪方及其有效成分控制胃癌的研究》文中进行了进一步梳理引言胃癌是严重危害人民健康及生命的消化道恶性肿瘤,胃癌发病率在全球范围恶性肿瘤中位居第4位,在我国发病率位居第2位,在江苏扬州恶性肿瘤死亡率中位居第1位。我国胃癌患者处于晚期居多,治疗效果较差,预后不佳,治疗手段以化疗为主。但是晚期胃癌患者身体一般情况差,加上化疗药物对消化道、骨髓功能、免疫系统、肝脏、肾脏等的毒副反应,患者化疗耐受性差,如何优化化疗的用药,是肿瘤临床医师重要工作。中药复方和化疗药物的联用,可以减毒增效,提高生活质量,延长生存期。依据胃癌患者运化功能差,对毒邪的转运、排泄、化灭等功能的不畅,运化毒邪方是多年来根据胃癌自身特点所自主创新研发的治疗胃癌的药方（由黄芪、人参、炒白术、炒苡仁、蛇舌草、莪术、龙葵、蒲公英、茯苓、炙甘草组成）。课题在构建中医肿瘤数据样本库、胃癌人源性癌组织移植瘤模型等关键技术的基础上,从临床、细胞、动物水平系统研究了运化毒邪方抗胃癌的作用,及从Claudin-4/VEGF-C/GSK3β信号网络调控初步研究运化毒邪方可能的抗胃癌作用机制。进一步分析了运化毒邪方化学成分,选取活性成分之一人参皂苷Rg3进行抗胃癌研究,并从剂型改造上（VEGFR-3抗体结合人参皂苷Rg3纳米乳剂）提高人参皂甙Rg3“运”的能力,提高“化”的作用,进一步完善运化思想治疗胃癌。本课题共分为六部分研究内容。第1章:从毒邪治疗胃癌理论架构1.1毒邪理论治疗肿瘤源流及辨治要法从毒邪论治是肿瘤治疗的核心问题之一,本文系统梳理了从毒邪理论治疗肿瘤的源流:秦汉时期是毒邪学说论治肿瘤的萌芽期,晋隋唐宋时期大致构建了毒邪学说的框架,即毒邪的分类、内涵、病因病机特点。明清时期进一步认识到外感疫毒这一因素,现代以来多位医家提出“癌毒”这一概念。恶性肿瘤的治疗应在扶正祛邪的总体治疗原则下,特别重视毒邪这一重要病理因素,根据毒邪在恶性肿瘤发生发展过程中的证素、证候特征,病机规律等,阐述了扶正祛毒、清热解毒、理气排毒、祛瘀化毒、化痰散毒、祛风摄毒、泄浊解毒、安邪休毒、灭虫化毒、以毒攻毒等十种抗肿瘤的辨治法则,同时结合现代科学研究成果,逐步完善从毒邪论治恶性肿瘤的理论体系的框架结构。1.2基于“脾主运化”理论论治胃癌基于经典中医理论及医学科学不断发展,胃癌与“脾主运化”理论存在密切的联系。从脾主运化的理论渊源,脾失运化、毒邪侵犯的胃癌病机,从脾主运化论治胃癌方略等角度进行探讨,以期提高诊治胃癌疗效、改善胃癌预后。第2章 运化毒邪方对进展期胃癌复发转移干预的临床研究目的:探讨运化毒邪方干预进展期胃癌患者的临床疗效,观察运化毒邪方干预治疗对胃癌患者血清代谢物及代谢通路的影响。方法:以中医肿瘤网页版信息数据库为依托,对中医肿瘤病人信息进行结构化设计,整合患者基本信息、中医临床信息等相关信息,实现在线查询统计功能。选取2016年2月-2019年3月扬州市中医院收治的98例晚期胃癌患者为研究对象。采用同期对照、非随机临床研究方法,将符合标准病例纳入中药组和化疗组,每组各49例。对照组采用奥沙利铂、替吉奥方案,中药组在对照组的基础上口服运化毒邪方。16例患者血清样本进行衍生化处理,在气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOFMS）检测器分析。结果:经中医药、化疗治疗4个疗程后评价,治疗后化疗组PR为19例,SD为17例,临床有效率为38.77%,疾病控制率为73.47%;中药组PR为24例,SD为21例,临床有效率为48.98%,疾病控制率为91.84%,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）;治疗后中药组KPS、ECOG评分显着升高,CEA、CA199、CA724水平均显着降低,两组治疗前后比较差异具有统计学意义（P<0.05）;中药组肝肾功能损伤、胃肠道反应、骨髓抑制的不良反应发生情况均低于对照组,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）;化疗组患者的一年生存率明显低于中药组,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）;中医药干预、年龄、体重、TNM分期、卡氏评分、手术方式等因素与进展期胃癌的无进展生存期相关,中药治疗、手术方式、体重为影响进展期胃癌的生存期的独立性相关因素。运化毒邪方干预胃癌治疗,主要涉及半乳糖代谢通路、支链氨基酸代谢通路,干预L-异亮氨酸、L-丝氨酸、L-亮氨酸、D-半乳糖、蔗糖、3-甲基-2-氧代戊酸的代谢结论:运化毒邪方治疗可以延长进展期胃癌患者生存期、提高生活质量、减轻“奥沙利铂、替吉奥”方案化疗毒副反应,是进展期胃癌预后的独立保护性因素,对胃癌患者血清代谢组学影响主要涉及半乳糖代谢通路、支链氨基酸代谢通路。第3章:运化毒邪方对胃癌生长及介导Claudin-4调控上皮间质转化信号通路的作用目的:探讨运化毒邪方对胃癌细胞及胃癌人源肿瘤异种移植瘤生长及相关蛋白和mRNA表达的影响。方法:MTT比色法检测对运化毒邪方人胃癌细胞增殖能力的影响,划痕实验检测细胞迁移,建立胃癌人源肿瘤异种移植（Patient-Derived tumor Xenograft,PDTX）模型,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测 GSK3β、VEGF-C、Claudin-4 蛋白表达,qPCR 检测 GSK3β、VEGF-C、Claudin-4 mRNA 的表达。结果:运化毒邪方1、2、4、8、16、32 mg/mL处理24、48 h,细胞呈不同程度的生长抑制作用,并且有一定的浓度依赖性。与空白组比较,运化毒邪方3、6 mg/mL 干预 AGS、BGC-803、SGC-7901 细胞 24h 后,运化毒邪方 3、6mg/mL组划痕距离明显降低（P<0.05）。运化毒邪方高剂量组的平均肿瘤体积与阴性对照组相比较,有明显差异,并且统计学分析上有明显差异;运化毒邪方低剂量组和运化毒邪方中剂量组的平均肿瘤体积与阴性对照组相比较,有降低趋势,但统计学分析上没有明显差异。运化毒邪方高剂量组的平均肿瘤重量与阴性对照组相比较,有明显差异,并且统计学分析上有明显差异。运化毒邪方干预后AGS、BGC803、SGC7901细胞及肿瘤组织中GSK3β蛋白及mRNA的表达水平增加,VEGF-C、Claudin-4蛋白及mRNA的表达水平降低。结论:运化毒邪方可通过抑制上皮间质转化相关蛋白的表达水平和促进抑癌基因相关蛋白的表达水平来共同发挥抑制胃癌生长、侵袭力和转移力的作用。第4章:基于高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）联用技术的运化毒邪方化学成分研究目的:分析运化毒邪方的化学成分,探讨其发挥药效的化学成分。方法:按照运化毒邪方处方中草药比例制备水煎液,采用HPLC-MS联用技术鉴定水煎液中的化学成分。结果:运化毒邪方水煎液在正负离子模式下共检测到1 12种化学活性成分,其中质谱响应强度大于50000的活性成分共有59种,按质谱响应强度排序依次为:甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、芒柄花苷、甘草酸、7-羟基-4’-甲氧基异黄酮、4’,7-二羟基黄酮、2’,4,4’-三羟基查耳酮、甘草素、异甘草素、甘草醇、毛蕊异黄酮、（3R）-2’,3’-二羟基-7,4’-二甲氧基异黄酮、汉黄芩素、樱黄素、芫花素、芒柄花素、人参黄酮忒、芸香苷、绿原酸、人参皂苷Ro、对-香豆酸、人参皂苷Rg7、人参皂苷Rf、人参皂苷Rg1、珠子参甙F2、珠子参甙F4、槲皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷、异槲皮苷、东茛菪素、东莨菪内酯、人参皂苷Rg3、人参皂苷F2、人参皂苷Rg2、穿心莲内酯、α-檀香醇、木犀草素、蒙花忒、姜黄素、甘草香豆素、咖啡酸、三叶豆甙、人参皂苷R2、人参皂苷F3、竹节皂苷L8、半甘草异黄酮B、柚皮苷、人参皂苷Rb1、白术内酯、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、绞股蓝皂苷ⅩⅦ、棕榈酸、十六酸、茯苓新酸G、24-羟基甘草次酸甲酯、人参皂苷Rh4、人参皂苷Rk3、甘草次酸。经液相测试,样品中人参皂苷Rg3的含量为 3.67ppm。结论:运化毒邪方含有人参皂苷Rg3等皂苷类31种,黄酮类也有三十多种。第5章:运化毒邪方主要活性成分之一人参皂苷Rg3对胃癌生长及Claudin-4/VEGF-C/GSK3β 通路调控作用目的:运化毒邪方主要组成药物之一即为人参,人参皂苷Rg3是中药材人参的主要活性成分之一,探讨人参皂苷Rg3抗胃肿瘤作用及可能机制。方法:MTT比色法检测对人胃癌细胞（AGS、BGC-803、SGC-7901）增殖能力的影响,划痕实验检测细胞迁移,建立胃癌人源肿瘤异种移植模型,Western blot、qPCR 检测 Claudin-4/VEGF-C/GSK3β通路蛋白及 mRNA 的表达。结果:人参皂苷Rg3 1、2、4、8、16、32mg/L处理胃癌细胞24、48h,细胞呈不同程度的生长抑制作用。人参皂苷Rg3给药24 h后,对SGC-7901、AGS、BGC-803细胞的生长呈明显抑制作用,24h IC50值依次分别为12.48、31.53、13.05mg/mL。4、8mg/L 的人参皂苷 Rg3 干预 BGC-803、AGS、SGC-7901 细胞 24 h后,划痕距离明显降低。应用人参皂苷Rg3高剂量组（20mg/kg）的平均肿瘤重量与阴性对照组相比较,有明显差异,并且统计学分析上有明显差异。与对照组比较,AGS、BGC-803、SGC-7901细胞经过人参皂苷Rg3 4、8mg/L作用24 h后,荷瘤裸鼠人参皂苷Rg3低、高剂量（10mg/kg、20mg/kg）,随着药物质量浓度的增加,AGS、BGC803、SGC7901细胞及肿瘤组织中GSK3β蛋白及mRNA的表达水平增加,VEGF-C、Claudin-4蛋白及mRNA的表达水平降低。结论:运化毒邪方中有效成分之一人参皂苷Rg3的有抗胃癌作用及对Claudin-4/VEGF-C/GSK3β信号通路有一定调节作用。特别是人参皂苷Rg3对胃癌人源动物模型有抗肿瘤作用,进一步证实人参皂苷Rg3对人体胃癌抑制作用的可靠性。第6章:VEGFR3靶向性纳米人参皂甙Rg3对原位胃癌小鼠移植瘤的影响目的:本研究的目的是研究VEGFR3靶向性纳米人参皂甙Rg3（VEGFR3-mediatedimmune-nanoemulsion of ginsenoside Rg3,VRIN）对原位胃癌小鼠肿瘤生长和转移的抑制作用。方法:建立了裸鼠原位胃癌模型用红色荧光蛋白（RFP）表达人胃癌细胞系NUGC-4-RFP。用溶媒处理荷瘤小鼠（0.2ml生理盐水,每隔一天,静脉注射）,5-FU（20mg/kg,每周一次,静脉注射）和VRIN（每隔一天1 mg/kg,静脉注射）。实时荧光对各组进行影像学检查以评估肿瘤抑制情况。用开放式荧光成像技术评估转移情况。采用免疫组化和实时RCP法检测肿瘤组织中VEGF-C、VEDF-D和VEGFR-3的表达。结果:VRIN和5-FU显着抑制原发性肿瘤的生长（p<0.05）。然而,显着抑制淋巴结转移仅见于VRIN治疗组（p<0.05）。与生理盐水组对比,VRIN治疗可抑制肿瘤中 VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3 的表达（p<0.05）;VEGF-D 和VEGFR-3在5-FU组表达无显着性差异（p>0.05）。VRIN组和5-FU组均无明显毒性。结论:VEGFR3靶向性纳米人参皂甙Rg3能抑制胃癌生长,通过抑制VEGF-C、VEGF-D和VEGFR-3的表达降低淋巴转移。研究显示了中医药可有效靶向治疗转移性胃癌。
李永红[6]（2020）在《空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究》文中提出研究目的以手术及放化疗为主的胃癌治疗已经进入平台期。过去三十年中,以凋亡蛋白为靶标的新型抗肿瘤药物研发取得了一定的进展,但受凋亡蛋白高频可变剪接、肿瘤异质性等因素的影响,凋亡相关靶向药物在临床应用特别是在胃癌等实体肿瘤中疗效欠佳。因此,基于凋亡因子可变剪接调控的抗肿瘤研究引起广泛关注,但在胃癌中的相关研究尚未见相关报道。Mcl-1分子是Bcl-2凋亡基因家族的核心成员,Mcl-1 pre-mRNA可通过可变剪接表达抗凋亡蛋白Mcl-1L和促凋亡蛋白Mcl-1S两种剪接异构体。基于Mcl-1可变剪接的干预有望通过改变肿瘤细胞抗凋亡状态、促进肿瘤细胞凋亡而成为胃癌治疗的新策略和新靶点。本研究通过临床研究,明确凋亡因子Mcl-1可变剪接与胃癌病理分级、临床分期、生存预后的相关性;通过细胞学实验,探讨空间阻滞寡核苷酸（SBOs）调控Mcl-1可变剪接进而促进胃癌细胞凋亡,抑制胃癌细胞增殖的生物学效应;通过裸鼠移植瘤实验,在体内验证SBOs治疗对肿瘤组织Mcl-1可变剪接的调控作用及其促进肿瘤组织细胞凋亡、抑制肿瘤生长增殖的作用。研究方法临床研究:应用基因表达谱交互分析软件GEPIA分析来源于TCGA数据库的408例胃癌组织以及36例正常胃粘膜组织中Mcl-1 mRNA表达情况及其与胃癌病理分级、临床分期、生存预后之间的相关性;收集59例胃腺癌患者新鲜胃癌组织和31例胃炎患者胃黏膜组织,应用荧光定量PCR技术定量检测Mcl-1可变剪接产物Mcl-1L及Mcl-1S的mRNA表达;利用Western blotting技术对Mcl-1L及Mcl-1S蛋白表达水平进行半定量检测;Mcl-1L及Mcl-1S表达水平与胃癌病理分级、临床TNM分期、生存预后的相关性分析。体外实验:合成Mcl-1特异性SBOs,应用Endo-Porter系统转染至不同分化程度的胃癌细胞系（MKN-28（高分化）、SGC-7901（中分化）、MKN-45（低分化））;RT-q PCR及Western blotting技术检测转染不同浓度SBOs细胞的Mcl-1L及Mcl-1S mRNA和蛋白的表达;应用流式细胞术检测转染不同浓度SBOs胃癌细胞的凋亡率;Western blotting检测细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）,评价转染不同浓度SBOs胃癌细胞的凋亡活化状态;CCK8增殖实验评价转染不同浓度SBOs胃癌细胞的增殖能力。体内实验:应用胃癌细胞系种植裸鼠背前壁皮下部位建立MKN-45和HGC-27两种胃癌移植瘤模型;通过瘤体局部多点注射不同剂量Mcl-1特异性SBOs,注射3天后处死裸鼠;记录裸鼠移植瘤体积治疗前后变化并组间比对分析;RT-q PCR及Western blotting技术检测不同浓度SBOs治疗后癌组织Mcl-1L及Mcl-1S mRNA和蛋白的表达;HE染色后计算SBOs治疗后肿瘤组织细胞死亡面积;免疫荧光技术原位观察肿瘤组织细胞凋亡;组织研磨后制备组织细胞悬液,应用流式细胞术检测肿瘤组织细胞凋亡率,同时应用Western blotting检测细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）,评价不同剂量SBOs治疗的胃癌组织的肿瘤凋亡活化状态;应用免疫组化技术检测细胞增殖指标Ki-67表达。研究结果临床研究:与正常胃粘膜组织相比,肿瘤组织中Mcl-1L mRNA表达显着升高（p<0.05）,与之相反,Mcl-1S mRNA表达则显着降低（p<0.01）,Mcl-1S/Mcl-1L mRNA亦明显降低（p<0.001）;与mRNA表达水平差异相一致,在胃癌组织中,Mcl-1L蛋白表达明显升高,Mcl-1S蛋白表达水平显着降低;同时,Mcl-1S与Mcl-1L mRNA表达水平的比值与胃癌T分期呈负相关,与N分期无明显关联性;Kaplan Meier生存分析显示,低Mcl-1S/Mcl-1L mRNA水平胃癌患者的总生存期低于Mcl-1S/Mcl-1L mRNA高水平胃癌患者。体外实验:相对GES-1正常细胞,不同分化程度的胃癌细胞系MKN-28、SGC-7901、MKN-45中Mcl-1L表达明显升高,Mcl-1S表达显着降低,但胃癌细胞株组间无显着差异;转染不同浓度SBOs 48 h后,Mcl-1L mRNA表达水平呈SBOs剂量依赖性降低,而Mcl-1S mRNA表达水平呈SBOs剂量依赖性增加;与mRNA水平的定量变化相似,SBOs处理的胃癌细胞系中,Mcl-1L蛋白表达水平下降,Mcl-1S蛋白表达水平升高;流式细胞术检测SBOs处理的胃癌细胞系显示三株细胞凋亡率均呈SBOs剂量依赖性升高;SBOs处理的胃癌细胞系中,细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）表达显着升高;转染不同浓度SBOs胃癌细胞的CCK8 OD值呈SBOs剂量依赖性升高。体内实验:SBOs治疗后,MKN-45和HGC-27两种小鼠移植瘤组织中Mcl-1S mRNA及蛋白表达上调,而Mcl-1L表达显着下调;肿瘤组织HE染色显示,相对于对照组,SBOs治疗组移植瘤组织细胞死亡面积呈SBOs剂量依赖性增加;免疫荧光原位检测显示,治疗后癌组织原位肿瘤细胞凋亡数量亦呈SBOs剂量依赖性增加;流式细胞术定量检测细胞凋亡显示,MKN-45异种移植模型中Con-SBO、6.25和12.5 mg/kg SBOs治疗组肿瘤细胞凋亡率分别为2.76%、14.44%和28.75%,在HGC-27异种移植模型中肿瘤细胞凋亡率分别为2.49%、31.26%和50.57%;SBOs治疗后,肿瘤组织中细胞凋亡关键标志物Bak、cleaved caspase9和cleaved caspase 3表达水平明显升高;SBOs治疗组肿瘤体积基本保持稳定,而对照组肿瘤体积增长超过30%;免疫组化检测显示,SBOs治疗组肿瘤生存能力和增殖的指标Ki-67表达率呈SBOs剂量依赖性下降。研究结论1.凋亡因子Mcl-1可变剪接异构体Mcl-1L和Mcl-1S在胃癌中表达不平衡,与胃癌临床进展及预后不良密切相关。2.Mcl-1特异性SBOs可以调控Mcl-1 pre-mRNA可变剪接从Mcl-1L转换为Mcl-1S mRNA剪接模式,抑制抗凋亡可变剪接异构体Mcl-1L的表达,诱导促凋亡异构体Mcl-1S的表达;这种干预能有效促进不同分化程度胃癌细胞的凋亡并抑制胃癌细胞增殖。3.在活体肿瘤组织内Mcl-1特异性SBOs亦可靶向调控Mcl-1 pre-mRNA可变剪接,使剪接模式从Mcl-1L向Mcl-1S mRNA转换,进而诱导胃癌移植瘤组织细胞凋亡并抑制移植瘤增殖和生长。4、以Mcl-1可变剪接为靶标的细胞凋亡调控,具有较高的特异性和有效性可作为抗胃癌治疗的新方向。
瞿静[7]（2020）在《肺癌靶向性丝素/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物》文中指出肺癌是威胁人类健康的重大疾病之一。恶性肿瘤的基因疗法因具有针对性强、毒副作用小、疗效好等优势而备受关注。生长抑制因子4（ING4）和白细胞介素-24（IL-24）基因能分别从细胞内、外两条途径抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡。腺病毒作为基因传递载体能够高效地传递和表达目的基因,但因存在免疫原性风险、高滴度时的细胞毒性、对固有受体细胞的趋向性等不足,限制了其在临床的广泛应用。柞蚕丝素蛋白具有优异的生物相容性和低免疫原性,并且包含的大量极性氨基酸残基赋予其丰富的化学反应活性和修饰位点。为了进一步提高腺病毒作为ING4-IL-24双基因传递载体的感染效率,以减少其有效使用滴度,降低其毒副作用,同时为了保护腺病毒免受腺病毒血清抗体的中和,本课题研制一种新型的肺癌靶向性的阳离子化柞蚕丝素/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物。通过体外实验和动物实验,研究该复合物对肺癌细胞的靶向感染作用、抑制生长作用、促进凋亡作用,以及对正常组织细胞的毒性。以期使用较低滴度的腺病毒,达到有效的抑制肺癌效果,避免使用高滴度腺病毒的潜在毒副作用。为实现这一目标,本文采用低分子量聚乙烯亚胺对柞蚕丝素蛋白进行阳离子化改性,并在丝素蛋白的侧链接枝肺癌细胞特异性寡肽C9（CSNIDARAC）,用此肺癌细胞靶向的阳离子化柞蚕丝素包被ING4-IL-24双基因共表达腺病毒,获得肺癌靶向性丝素/ING4-IL-24双基因共表达复合物。体外研究复合物对肺癌细胞H460的靶向作用、感染效率、抑制增殖和诱导凋亡作用,体内研究复合物对小鼠H460肺癌移植瘤的生长抑制作用及抑癌机制,同时通过体外、体内实验,分析和评价复合物对正常细胞脐静脉内皮细胞HUVEC和正常组织的毒副作用。首先,构建ING4-IL-24双基因共表达腺病毒载体。将ING4-IL-24双基因共表达转移质粒与腺病毒骨架质粒同源重组后感染人胚肾细胞QBI-293A,多次扩增后获得ING4-IL-24双基因共表达腺病毒（Ad）。Western blotting和ELISA测试结果表明,腺病毒能介导外源性的ING4和IL-24基因在人胚肾细胞QBI-293A细胞中表达。其次,在碳二亚胺的介导下,使低分子量聚乙烯亚胺（PEI）的氨基与柞蚕丝素蛋白（ASF）的羧基偶联后生成酰胺键,获得阳离子化柞蚕丝素蛋白（CASF）。当参加反应的PEI占柞蚕丝素的质量百分比为4%时,改性后柞蚕丝素蛋白的表面Zeta电位达到+12.03 mV,接枝效率约为86.34%。接着,以3-（2-吡啶二硫）丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯作为交联剂,将肺癌细胞特异性寡肽C9以二硫键的形式接枝到阳离子化柞蚕丝素蛋白的侧链,制得肺癌细胞靶向性柞蚕丝素蛋白（CASF-C9）,实验结果表明,CASF-C9的表面Zeta电位较CASF有所下降。为了初步评价CASF-C9装载基因的能力及其生物学效应,先用CASF-C9包装质粒DNA（pDNA）,制备不同质量比的CASF-C9/pDNA复合物。实验结果显示,CASF-C9与pDNA质量比为64/2、128/2、256/2时,能够完全包裹住质粒DNA。CASF-C9/pDNA复合物转染肺癌细胞H460后表达绿色荧光的细胞数量和转染效率显着高于对照组CASF/pDNA复合物,并且接枝寡肽C9的量越高,表达荧光的细胞数量和基因转染效率越高,CASF-C9/pDNA复合物对H460细胞增殖的抑制作用也更显着。在此基础上,用CASF-C9依靠静电吸附作用包被腺病毒载体,制备肺癌靶向性丝素/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物CASF-C9/Ad。从形貌、表面Zeta电位和粒径分布的检测结果可知,复合物呈球形或类球形颗粒,其表面Zeta电位和粒径均随着包覆于腺病毒表面的CASF-C9浓度的增加而增大。对CASF-C9进行异硫氰酸荧光素标记,研究短肽C9对肺癌细胞H460的靶向识别作用。激光共聚焦显微镜观察和分析结果表明,接枝短肽C9的CASF-C9及复合物CASF-C9/Ad均能特异性识别并粘附至肺癌细胞H460的表面,提示复合物CASF-C9/Ad具有肺癌细胞靶向性,具有以较低滴度的复合物达到有效感染肺癌细胞的潜力。进一步,用CASF-C9/Ad复合物体外分别感染肺癌细胞H460和脐静脉内皮细胞HUVEC,检测荧光表达和感染效率。研究结果表明,H460细胞和HUVEC细胞感染复合物CASF-C9/Ad后的荧光表达强度和感染效率均显着高于对照组裸Ad。H460细胞感染复合物CASF-C9/Ad后的生长受到了明显的抑制,细胞存活率显着低于对照组裸Ad和CASF/Ad复合物。复合物CASF-C9/Ad中的目的基因ING4和IL-24均能在肺癌细胞H460中有效表达并诱导细胞凋亡。感染复合物CASF-C9/Ad的H460细胞凋亡率显着高于对照组裸Ad和CASF/Ad复合物。而与H460细胞完全不同,HUVEC细胞感染CASF-C9/Ad复合物后,其细胞形态和细胞增殖活力均未受到明显的影响。证明CASF-C9/Ad复合物对肺癌细胞具有明显的靶向性和抑制增殖、促进凋亡效应,而对正常细胞无明显毒性。最后,用ING4-IL-24双基因共表达CASF-C9/Ad复合物体内治疗小鼠H460肺癌移植瘤。肺癌移植瘤的体积变化、肿瘤重量、抑瘤率的检测结果证明,CASF-C9/Ad能显着抑制肺癌移植瘤的生长,抑瘤率显着高于对照组裸Ad和CASF/Ad复合物。经复合物CASF-C9/Ad治疗后的肿瘤组织出现大片坏死灶,肿瘤细胞崩解、胞核染色消失,肿瘤细胞发生肿胀,呈空泡化结构,细胞膜出现连续性破坏。经复合物CASF-C9/Ad治疗后的肿瘤组织坏死程度较对照组裸Ad和CASF/Ad复合物更显着。双基因共表达复合物CASF-C9/Ad能够将目的基因ING4和IL-24高效递送至肺癌细胞,通过下调Ki 67、Bcl-2的表达抑制肺癌细胞增殖;通过上调C Caspase-3、Bax的表达促进肺癌细胞凋亡;通过下调VEGF、CD31的表达阻断肿瘤血管新生,多途径实现对小鼠H460肺癌移植瘤的抑瘤效应。本文将肺癌细胞特异性的寡肽CSNIDARAC接枝到柞蚕丝素蛋白侧链,构建能靶向识别和感染肺癌细胞的阳离子化柞蚕丝素蛋白/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物CASF-C9/Ad。该复合物不仅能靶向、高效地将目的基因递送至肺癌细胞,减少腺病毒的有效使用滴度;也能屏蔽腺病毒与宿主的直接作用,保护腺病毒免受血清抗体的中和,降低腺病毒的免疫原性风险;同时对正常细胞无明显毒性。动物实验证明,复合物CASF-C9/Ad通过抑制肺癌细胞增殖、促进肺癌细胞凋亡、阻断肿瘤血管新生等多种途径实现抑瘤效应。
胡锦涛[8]（2020）在《谷氨酰胺代谢在垂体腺瘤增殖中的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:垂体腺瘤是常见的原发性颅内肿瘤,根据激素分泌情况,垂体腺瘤可分为功能性腺瘤和临床非功能性（nonfunctioning,NF）腺瘤。催乳素腺瘤、生长激素（growth hormone,GH）分泌腺瘤、促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone,ACTH）分泌腺瘤以及NF腺瘤是垂体腺瘤最常见的四种亚型。虽然是良性肿瘤,但它们会引发颅内占位效应,功能性腺瘤还会显着干扰体内激素水平。在四种最常见的垂体腺瘤亚型中,与库欣病（分泌ACTH）、肢端肥大症（分泌GH）和NF腺瘤相关的肿瘤亚型通常采用经蝶窦手术作为一线治疗。然而,由于部分垂体腺瘤可能侵犯颈内动脉海绵窦或鞍区周围骨质,有时很难实现肿瘤全切除。且手术难以避免会带来新的风险。除催乳素腺瘤外,现有药物治疗往往作为手术治疗的补充。这些药物同时具有抗激素分泌和抗肿瘤的效果,大多数催乳素腺瘤对卡麦角林等多巴胺受体激动剂敏感,然而,肢端肥大症和库欣病对奥曲肽和帕瑞肽等生长抑素类似物类药物反应差异较大。并且这些药物通常需要长期服用,并需要定期监测生化控制程度及副反应。放射治疗也是手术后残余肿瘤以及复发肿瘤或无法手术患者的一个选择,但是放疗有可能会对垂体腺瘤周围正常组织,如视神经等造成损伤。因此,寻找新的治疗垂体腺瘤的方法仍是目前的临床重点。代谢异常被认为是肿瘤细胞的特征之一。虽然垂体腺瘤是良性肿瘤,但也有证据表明存在代谢重构。几项研究通过代谢组学分析或核磁共振波谱分析证实了垂体腺瘤与正常垂体之间或不同肿瘤亚型之间代谢物的差异。我们之前报道过乳酸脱氢酶A是糖酵解的关键酶,在侵袭性垂体腺瘤中高表达,是一个潜在的治疗靶点。然而,尽管代谢物发生了变化,但具体的治疗靶点通常是代谢相关酶。这些酶的表达水平改变代谢流,可以在转录水平上检测到。丰富的转录组学数据使我们能够系统地研究肿瘤的各种代谢重组。然而到目前为止还没有任何关于垂体腺瘤发生发展的代谢相关基因和潜在的机制的组学研究。研究方法:在基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus database,GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中搜索“pituitary”“pituitary adenoma”“pituitary tumor”“prolactinoma”“growth hormone”and“Cushing disease”,检索人垂体腺瘤可下载原始芯片数据。经过标准化处理并移除批次效应后,我们将四种肿瘤亚型的基因表达数据分别与正常对照相比,得出四种亚型的差异表达基因。随后用维恩图找出其重叠部分,进而得到各肿瘤亚型所特有的差异表达基因。随后对这些亚型肿瘤特异性差异表达基因进行GO（gene ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）功能富集,并找出其中与代谢相关的通路以及参与其中的差异表达基因。最后建立人蛋白-蛋白互作网络进一步阐明代谢相关差异表达基因与其他差异表达基因直接的相互作用关系。结果:1.整合基因芯片数据并识别差异表达基因1.1我们从GEO数据库得到9个垂体腺瘤基因表达数据集,其中共有160例标本信息,包括52例ACTH腺瘤,38例GH腺瘤,40例NF腺瘤,9例PRL腺瘤以及21例正常垂体.1.2 GH垂体腺瘤与正常垂体相比有512个差异表达基因,ACTH垂体腺瘤有392个差异表达基因,PRL垂体腺瘤有1581个差异表达基因,NF垂体腺瘤有1149个差异表达基因。2.亚型特异性差异表达基因的识别及KEGG通路分析2.1利用维恩图发现分泌ACTH的垂体腺瘤有0个特异性差异表达基因,分泌GH的垂体腺瘤有22个特异性差异表达基因,分泌PRL的垂体腺瘤有1081个特异性差异表达基因,NF垂体腺瘤有437个特异性差异表达基因,在四种亚型所共有的217个差异表达基因,我们称之为共有差异表达基因。2.2 PRL垂体腺瘤特异性差异表达基因主要富集在破骨细胞分化、弓形虫病、炎症性肠病和凋亡通路。NF垂体腺瘤特异性差异表达基因主要富集在鞘糖脂合成、c AMP信号通路、蛋白酶体和含血清素的神经突触通路。共有差异表达基因主要富集在PI3K-Akt信号通路,细胞外基质-受体相互作用、TGF-β信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路。此外,我们注意到PRL和NF垂体腺瘤特异性差异表达基因富集到的前20个KEGG通路中,分别有6个和7个代谢相关通路。3.代谢相关的KEGG通路和GO条目分析3.1共有差异表达基因仅在两种KEGG代谢途径中富集:细胞色素P450对外源生物的代谢和硫代谢。GO条目富集到葡萄糖稳态和维甲酸代谢过程。3.2 PRL垂体腺瘤特异性差异表达基因富集到了6个代谢相关KEGG通路:磷酸戊糖途径,果糖和甘露糖代谢,脂肪酸降解、色氨酸代谢、丙氨酸代谢和碳代谢。3.3 NF垂体腺瘤特异性差异表达基因富集到了12个代谢相关KEGG通路:类固醇生物合成,精氨酸生物合成,嘌呤代谢,半胱氨酸和蛋氨酸代谢,酪氨酸代谢,粘多糖生物合成-肝素/肝素,花生四烯酸代谢,代谢亚油酸,亚麻酸的新陈代谢,鞘糖脂合成,泛酸盐和辅酶a生物合成,硫代谢。4.蛋白-蛋白相互作用（Protein–protein interaction,PPI）网络的建立及分析共有差异表达基因的PPI网络中PDK4和PCK1是与其他人蛋白质连接（网络度）最多的两个代谢酶。不仅如此,PDK4还连接到网络中的一个枢纽蛋白STAT5b。PRL特异性差异表达基因的PPI网络富集在乙酰辅酶A、核苷酸合成以及γ-氨基丁酸和5-羟色胺的生成反应,其中介导生成γ-氨基丁酸的谷氨酸羧化酶（glutamate decarboxylase 1,GAD1）与NF特异性差异表达基因PPI网络中的谷草转氨酶（glutamic-oxaloacetic transaminase 1,GOT1）涉及两种不同的谷氨酸代谢通路。结论:1.我们识别了不同垂体腺瘤激素亚型特异性表达的差异基因,并发现这些基因富集到数个代谢相关通路中。2.细胞色素P450对外源物质的代谢,硫代谢,葡萄糖稳态和维甲酸代谢过程在四种垂体腺瘤亚型中都有异常。PDK4和PCK1可能是垂体腺瘤中共有的潜在代谢相关关键分子和治疗靶点。3.PRL和NF垂体腺瘤均存在谷氨酸代谢以及糖异生、转氨基、脂质代谢、和核苷酸代谢等代谢异常。研究背景:第一部分研究结果提示在垂体腺瘤中谷氨酸相关的代谢通路可能存在异常变化。正常生理条件下,谷氨酸与有毒性的游离铵离子结合生成谷氨酰胺再转运到各处组织,然而在肿瘤细胞中大量谷氨酸的存在被认为是细胞摄取外源性谷氨酰胺之后分解所得。谷氨酰胺是人体含量最多的一种氨基酸,正常生理状态下可以由谷氨酸和铵离子在体内合成,因此是一种非必须氨基酸。然而,大多数癌症细胞在没有谷氨酰胺的培养环境下无法生存,这个现象被称为“谷氨酰胺依赖”现象。对于一些癌症细胞来说,谷氨酰胺是重要的能量来源,并且是很多大分子物质的合成前体,比如氨基酸、蛋白、脂质和核苷酸等。因此,谷氨酰胺缺乏会造成代谢压力并导致癌症细胞凋亡并不奇怪。以谷氨酰胺转运体或者谷氨酰胺分解酶为治疗靶点已在多项研究中被证实能有效抑制肿瘤细胞生长。代谢异常已被公认为是癌症的特质之一,较普遍的变化有“Warburg效应”和“谷氨酰胺依赖”两个现象。沃伯格效应是指癌症细胞即使在氧气充足的环境下依然优先进行无氧糖酵解的现象。虽然绝大多数垂体腺瘤是良性肿瘤,我们在前期研究中发现糖酵解关键酶乳酸脱氢酶A在垂体腺瘤的发生与发展中发挥重要作用,也证实了乳酸脱氢酶A有希望成为潜在的垂体腺瘤治疗靶点。垂体腺瘤是否存在“谷氨酰胺依赖”目前尚无研究报到。虽然已有研究通过磁共振波谱分析或者代谢组学的方法报道了谷氨酰胺或谷氨酸代谢在垂体腺瘤与正常组织或者在不同亚型的垂体腺瘤中存在差异。但是,谷氨酰胺在垂体腺瘤的病理生理过程中发挥怎样的作用目前仍是未知。研究方法:At T20,MMQ和GH3细胞在有或无谷氨酰胺环境下培养,用CCK-8方法检测细胞增殖进而得出三种细胞的生长曲线。左旋天冬酰胺酶可以清除培养基中的谷氨酰胺,因而被当做另一种方法证实去除谷氨酰胺对垂体腺瘤细胞的影响。然后我们检测了三种细胞系以及6例原代细胞在有/无谷氨酰胺环境下GS酶的表达情况。随后,用免疫组化方法检测了24例垂体腺瘤手术标本中GS酶的表达情况,包括5例生长激素腺瘤,5例ACTH腺瘤,5例PRL腺瘤和9例NF腺瘤。使用小干扰RNA或药物阻断GH3细胞GS酶,用流式细胞技术检测凋亡细胞数和细胞周期分布。最后用液相色谱质谱仪检测谷氨酰胺剥夺后GH3细胞内代谢物含量的变化。研究结果:1.GS表达水平决定垂体腺瘤细胞对无谷氨酰胺环境的敏感性1.1三种垂体腺瘤细胞系对去除外源性谷氨酰胺敏感性不同,GH3细胞基本不受影响,MMQ和At T20细胞的增殖分别被抑制了64%和20%。1.2 GH3细胞的GS酶蛋白表达水平显着高于MMQ和At T20细胞（p<0.001）,并且,去除外源性谷氨酰胺后,GH3细胞和At T20细胞的GS酶蛋白表达水平都显着升高,但是MMQ细胞没有显着变化。1.3 6例原代细胞有5例也在去除外源性谷氨酰胺后,GS酶蛋白表达水平都显着升高。1.4与对照组相比,小干扰RNA敲低GS的GH3细胞对去除外源性谷氨酰胺更敏感,但在完全培养基环境下无明显区别。1.5)联合左旋天冬酰胺酶和MSO可以抑制所以细胞系的增殖。2.人垂体腺瘤标本中GS的表达情况2.1我们将GS染色后免疫组化结果进行评分并从低到高划分为四个等级,统计结果表明大多数（87.5%）的人垂体腺瘤标本表达GS,只有3例基本不表达（评分为最低等级）。2.2 p53阳性和ki-67指数大于3%与更高的GS表达水平正相关。2.3生长激素腺瘤GS表达水平最高,与细胞系结果相同。3.对表达GS的GH3细胞同时阻断内源性和外源性谷氨酰胺,会阻碍核苷酸代谢和细胞周期进程3.1我们选择GH3细胞代表表达GS的细胞,同时阻断内源性和外源性谷氨酰胺不会诱导GH3细胞死亡,在谷氨酰胺饥饿三天后GH3细胞生长停滞,当是当再次补充谷氨酰胺后,GH3细胞可以重新增殖。3.2同时阻断内源性和外源性谷氨酰胺没有增加凋亡的GH3细胞,但是使细胞周期停滞在了S期。3.3同时阻断内源性和外源性谷氨酰胺后,谷氨酰胺参与补缺的下游代谢物α-酮戊二酸、琥珀酸和延胡索酸含量没有明显变化。3.4同时阻断内源性和外源性谷氨酰胺后,合成核苷酸的中间产物肌苷单磷酸（IMP）、脱氧胞苷三磷酸（d CTP）、脱氧胞苷单磷酸（d CMP）、三磷酸胞苷（CTP）、三磷酸腺苷（ATP）,鸟苷二磷酸（GDP）等代谢物含量显着降低。3.5变化代谢物的KEGG通路富集也表明嘌呤和嘧啶代谢途径是变化最显着的通路。3.6 d CTP回补部分挽救了谷氨酰胺饥饿引起的增殖阻滞。结论:1.垂体腺瘤细胞适应无谷氨酰胺环境需要GS酶的存在2.大部分垂体腺瘤细胞表达GS,且p53阳性和ki-67指数大于3%与更高的GS表达水平正相关。3.表达GS的垂体腺瘤细胞在左旋天冬酰胺酶和GS抑制剂联合作用下,核苷酸合成和细胞周期进展会受阻,进而细胞增殖被抑制。
赵宇翔[9]（2020）在《c-Myc通过上调GOT1和Nrf2抵抗肝癌细胞中谷氨酰胺剥夺诱发的铁死亡》文中指出背景:原发性肝癌是一种严重威胁全人类生命健康的疾病,而肝细胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）占所有原发性肝癌总数的比例高达90%,根据2015年世界肝癌流行病学统计,HCC在全球癌症中发病率位居第五,致死率位居第三,是一个主要的国际健康问题。自Warburg效应提出之后,葡萄糖一直是癌症代谢研究的核心,随之而来,对谷氨酰胺（Glutamine,Gln）等其他营养物质的研究也逐步成为肿瘤代谢研究的热点。谷氨酰胺是血清中最丰富的游离氨基酸,具有重要的生物学作用,比如可用于核苷酸、其他氨基酸和蛋白质合成、支持重要的抗氧化剂之一:谷胱甘肽（Glutathione,GSH）合成、其分解代谢产生的α-酮戊二酸（α-ketoglutarate,α-KG）也可以为三羧酸循环补充中间代谢物。因此,谷氨酰胺是肿瘤的条件必须氨基酸,谷氨酰胺成瘾也一直被认为是大多数肿瘤代谢特征之一。靶向谷氨酰胺代谢,研发其抑制剂作为抗肿瘤药物,为肿瘤治疗提供新的新方向。然而,临床实验证明这些抑制剂并不是对所有肿瘤有效,且单独使用这些抑制剂的治疗潜力有限。因此,阐明肿瘤细胞如何调控自身谷氨酰胺代谢抵抗谷氨酰戒断的治疗手段,并维持自身生存的机制,将为靶向谷氨酰胺代谢的抗肿瘤治疗提供新的治疗策略,具有重要的科学意义和潜在的临床价值。材料和方法:本研究首先对TCGA数据库中HCC/癌旁组织m RNA测序数据进行分析,确定肝癌组织中谷氨酰胺代谢关键酶的表达差异,并用q RT-PCR对这些关键酶在肝癌细胞与正常肝细胞的表达进行验证。然后分析了这些关键酶对临床患者的生存期的影响。其次,以肝癌细胞系作为实验模型,分别以谷氨酰胺剥夺及补充α-KG或铁死亡抑制剂Fer-1作为实验组,检测上述分组肝癌细胞数量,活力和死亡情况;利用试剂盒检测活性氧（active oxygen species,ROS）、GSH、谷氨酸（glutamate,Glu）及丙二醛（malondialdehyde,MDA）随时间的变化;用酶活测定试剂盒测定GSH合成,使用途径关键酶的酶活性。最后,通过western blot和q RT-PCR检测了的GOT1、c-Myc和Keap1-Nrf2信号通路与其下游GCLM和GPX4的表达。之后预测c-Myc与GOT1的表达相关性以及其潜在结合位点,并利用si RNA干扰c-Myc检测相关蛋白表达以验证c-Myc是其上游分子。利用染色质免疫共沉淀实验验证c-Myc和GOT1启动区的直接结合。利用si RNA干扰c-Myc或GOT1后检测了肝癌细胞的存活及氧化还原相关小分子含量。此外,我们构建谷氨酰胺剥夺的裸鼠移植瘤模型验证了c-Myc和GOT1在谷氨酰胺剥夺后对移植瘤生存及其GSH合成的影响。结果:研究发现GCL、GSS、GPX4和GSR在肝癌组织中表达上调,GOT1、GPT1和Gl UD1在肝癌组织表达下调,q RT-PCR实验结果验证了这些酶肝癌细胞Hep G2和SMMC-7721与正常肝细胞LO2中的表达差异。谷氨酰胺剥夺初期,肝癌细胞数量以及GSH含量减少,但是随着时间的增加,肝癌细胞的数量得到一定恢复并且GSH同样维持在正常水平,谷氨酰胺剥夺后补充α-KG能一定程度促进GSH合成和肝癌细胞生存,Fer-1无助于GSH合成但可抑制肝癌细胞死亡。谷氨酰胺剥夺后,GSH含量减少致使脂质过氧化水平升高,升高的ROS激活了Keap1-Nrf2-ARE信号通路,进而上调其下游的GCL以及GPX4的表达。此外,谷氨酰胺剥夺后上诱导了GOT1及c-Myc的m RNA和蛋白表达。GOT1及c-Myc在肝癌的表达具有相关性,GOT1启动区具备c-Myc潜在结合位点,并且Ch IP实验表明c-Myc直接结合于GOT1的启动区促进其表达。另外,肝癌细胞中其他GSH合成底物氨基酸转运体的m RNA表达在谷氨酰胺剥夺后上调。当GOT1被沉默,谷氨酰胺剥夺条件下的肝癌细胞生存及裸鼠移植瘤被明显抑制,且GSH含量维持在低水平,而ROS和MDA含量升高。当c-Myc被沉默,肝癌细胞及裸鼠移植瘤的GOT1、Nrf2、GCLM和GPX4表达被抑制。结论:1.谷氨酰胺在肝癌中分解代谢产生的Glu主要用于合成GSH以增强其抗氧化能力,而非进入TCA循环或者合成其他氨基酸。2.谷氨酰胺剥夺后,肝癌细胞GOT1和Nrf2表达上调,GOT1及Nrf2的下游分子共同完成了α-KG—Glu—GSH的合成途径,降低了ROS水平,进而抑制了铁死亡。3.谷氨酰胺剥夺激活c-Myc表达,c-Myc直接结合GOT1启动区促进其转录。沉默GOT1联合谷氨酰胺戒断可以更好达到抑制肝癌的效果。
薛志刚[10]（2020）在《免疫营养干预影响肠道微生态及胃肠肿瘤结局基础与临床初探》文中提出第一部分 肠内免疫营养干预在胃癌中对肠道菌群及肿瘤增殖的动物研究初探研究背景:胃癌的化疗最常见的毒副反应之一是胃肠道不良反应,主要表现包括胃肠动力功能障碍、肠道菌群失调及肠黏膜屏障受损。免疫营养在营养补充、调节免疫和维持肠道微生态方面发挥着重要作用。目前研究证据表明,免疫营养素如n-3多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids,PUFA）在结直肠癌、炎性肠病中起着维持肠道菌群平衡的作用,同时,有助于减少结直肠癌中化疗引起的肠道菌群紊乱,甚至与肿瘤预后存在一定的相关性。目前,在胃癌中关于化疗对肠道菌群的影响作用尚不清楚,免疫营养干预对胃癌肠道菌群的影响以及与肿瘤增殖的关系有待研究。研究目的:通过构建615小鼠胃癌移植瘤-化疗动物模型,初步探究胃癌中,化疗及移植瘤建立对肠道菌群的影响,通过给予胃癌化疗小鼠补充谷氨酰胺（Glutamine,GLN）和鱼油,探究补充免疫营养对肠道菌群和肿瘤增殖的作用。研究材料与方法:随机将36只6周龄雌性615小鼠分为一下6组:第1组化疗组（CON1,n=6）,分别在第3、6、9天腹腔注射5-Fu;第2-5组615小鼠皮下注射MFC前胃癌细胞（5X 106）构建胃癌移植瘤模型（当天记录为第0天）,随后予以5-Fu化疗干预构建胃癌-化疗动物模型,第2组不进行干预（CON2,n=6）,第3组生理盐水干预组（NS,n=6）,第4组为低剂量谷氨酰胺干预组（Low GLN/LG,n=6）,第5组为高剂量谷氨酰胺干预组（High GLN/HG,n=6）,第6组为鱼油干预组（PUFA,n=6）。在干预前基线（第-7天）、移植瘤前（第-1天）、2-5组第一次化疗前（第6天）及干预完成后第21天,留取新鲜粪便标本,采用16S rRNA方法测定肠道菌群。比较第2-5组移植瘤生长速率。定义p<0.05为显着统计学差异。结果:基线菌群特征结果显示,厚壁杆菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为主,前者占比为41%-57%,后者占比39%-56%,之和92%-98%,二者比值F/B 比在0.73-1.46之间。化疗干预后,厚壁菌门相对丰度显着增加,拟杆菌门显着下降,F/B 比升高为2.39,属水平上,艾克曼菌属（Akkermansia,Akk）比例显着下降（2%-4%→1%,p<0.01）。PUFA组厚壁菌门丰度显着降低、拟杆菌门显着升高,F/B比为1.0,维持在基线范围（0.73-1.46）,属水平上,Akk菌属相对丰度显着升高。HG组厚壁菌门丰度显着降低、拟杆菌门显着升高,F/B比为1.48。PUFA组移植瘤大小为0.26±0.23g,HG组移植瘤大小为0.32±0.18g,小于CON2组0.72 ±0.41g,未见显着统计学差异（P值分别为0.13和0.10）。结论:5-Fu化疗增加胃癌移植瘤小鼠肠道菌群中厚壁菌门相对丰度,减少拟杆菌门比例,F/B 比显着升高,Akk菌属比例下降,菌群结构改变。补充鱼油和谷氨酰胺可以逆转因化疗造成的菌群结构改变,维持肠道菌群F/B 比降低至正常范围,补充鱼油可以显着增加Akk菌属相对丰度,可能有助于抑制肿瘤增殖。第二部分 肠内营养干预对胃肠肿瘤肠道菌群特征及临床结局影响的初探研究背景:营养干预影响肠道菌群的研究方兴未艾,一方面,特定营养干预可能影响肠道菌群结构,另一方面,不同营养支持方式也可能影响肠道菌群结构。有研究提示,肠外营养干预可能造成肠道菌群多样性降低、菌群结构变化,同时,有研究提示菌群变化与感染并发症可能有关。胃肠肿瘤病人术前营养支持治疗预康复和术后早期肠内营养的理念越来越得到重视,围术期营养支持治疗,对肠道菌群的影响及术后感染相关并发症的研究较少,值得进行初步研究和分析。研究目的:初步探究围术期肠内营养干预对胃肠肿瘤病人肠道菌群以及对术后临床结局的影响。研究对象与方法:纳入北京协和医院基本外科接受择期手术的胃肠肿瘤病人,根据病人术前是否给以口服肠内营养支持进行预康复和术后早期肠内营养的围术期营养支持策略,将病人分为研究组和对照组。研究组术前口服肠内营养至少3天,每日至少500ml,根据加速康复理念,术后早期（第1-2天）给予肠内营养支持治疗。对照组,术前不进行肠内营养支持、术后3天禁食予以肠外营养及补液支持。分别于术前和术后5-7天留取新鲜粪便提取DNA,进行16S rRNA测序分析肠道菌群特征,记录术后感染并发症、总并发症及术后住院天数。定义p<0.05为显着统计学差异。结果:研究纳入2017年12月至2018年4月在择期胃肠肿瘤病人37例,其中对照组（CON组）24人,研究组（EN组）13人。在属水平上,艾克曼菌属（Akkermansia,Akk）在研究组和对照组分别为2%和<0.1%,术后分别为4%和0.4%,围术期肠内营养支持治疗后,Akk菌属比例增加。术前大肠志贺菌属（Escherichia Shigella）在EN组和CON组分别为9%和5%,术后分别为11%和19%。术后感染并发症EN组1例（8%）,CON组5例（21%）,术后总并发症分别为1例（8%）和9例（38%）,术后平均住院天数分别为8.0±2.1天和12.3±7.5天,但未见统计学差异。结论:围术期强化的肠内营养干预可以增加Akk菌属相对丰度,减少大肠志贺菌属比例,可能有助于减少术后感染并发症,加速术后康复。Akk菌作为潜在新型益生菌可能提示更好的术后临床结局。第三部分围术期肠内免疫营养干预对胃肠肿瘤临床结局的影响研究背景:围术期肠内营养支持可能有助于优化术后临床结局,加速术后康复。免疫营养素如鱼油有助于减少术后产生的炎症因子级联反应（inflammatory cascade）,抑制前炎症因子的过度活化,可能有助于减少术后并发症尤其感染并发症的发生。目前,在胃肠肿瘤病人围术期应用免疫营养减少感染并发症、实现加速康复,结论尚不一致。研究目的:研究围手术期补充免疫营养对胃肠肿瘤患者临床结局的影响。研究对象与方法:纳入北京协和医院基本外科接受择期手术的胃肠肿瘤病人,研究组,术前连续5天和术后7天补充免疫营养（速愈素饮或瑞能）,术前口服每日600-800ml、术后肠内途径序贯补充,对照组围术期营养支持治疗方案为普通型肠内营养或肠外营养（不含鱼油、精氨酸、核苷酸等免疫营养成分）。前瞻性收集病人术后感染并发症、总并发症和术后住院天数。感染并发症定义参考美国国家疾病与预防中心指定的医疗相关感染并发症。P<0.05为显着统计学差异。结果:纳入2016年9月至2019年12月在北京协和医院基本外科胃肠专业组连续收治的胃肠肿瘤患者190人,其中,研究组69人,对照组121人,胃癌105例、结直肠癌39例、胃肠间质瘤38例和小肠肿瘤8例。研究组和对照组术后感染并发症发生率分别为4.3%（3/69）和13.2%（16/121）,研究组显着低于对照组（p=0.003）,其中明确原因的主要感染并发症类型为消化道漏4.2%（8/190）和肺部感染2.6%（5/190）,术后总并发症,研究组亦显着低于对照组（p=0.039）。研究组术后平均住院天数为8.2±2.1天,显着低于对照组10.8±9.4天（p=0.030）。结论:围术期免疫营养干预可能有助于减少术后感染并发症和术后总并发症,缩短术后平均住院天数,有助于术后加速康复理念的实践。第四部分胃癌新辅助化疗结合营养支持对长期生存的影响研究背景:中国是胃癌的高发国家,局部进展期胃癌的治疗方法主要以手术联合围手术期治疗为主。近年来,关于新辅助化疗治疗胃癌的研究越来越多。胃癌病人营养不良比例高,新辅助化疗期间进行营养支持有助于改善营养情况,甚至可能影响病人长期生存。研究目的:本部分主要纳入我院胃癌新辅助化疗病人,研究新辅助化疗期间营养支持使得病人体重增加或维持,对胃癌病人长期生存预后的影响。研究对象与方法:纳入在中国医学科学院北京协和医院基本外科接受新辅助化疗及择期手术的胃癌病人作为研究对象,新辅助化疗方案SOX或XELOX方案,在化疗期间予以营养支持治疗,通过营养支持体重增加或维持不变者为研究组,未进行营养支持或术前1-3个月体重下降为对照组。随访病人长期生存信息。Kaplan-Meier方法分析并绘制生存曲线。结果:研究纳入在2014年1月至2019年12月期间符合纳入排除标准的胃癌病人274例,其中研究组214例,对照组60例。基线水平,两组年龄、性别、BMI、手术方式、病理分化及TNM分期均无显着差异。研究组五年总生存率为58.2%,对照组为32.6%,研究组显着高于对照组。结论:新辅助化疗结合营养支持,可能有助于改善病人营养状态、提高化疗耐受性和手术切除率,甚至可能改善长期生存。第五部分长期肠外营养在胃肠功能障碍中的应用及感染风险模型建立研究背景:肠功能障碍或肠衰竭病人肠内营养摄入不早,需要依赖长期肠外营养,从医院到家庭的模式转变,使得未来家庭肠外营养（Home parenteral nutrition,HPN）成为趋势。长期肠外营养病人中,中心静脉导管相关血流感染（Central line-associated bloodstream infection,CLABSI）是 HPN 最严重、威肋生命的并发症之 一。研究感染相关风险因素,有助于早期识别高危人群,预防CLABSI发生。研究目的:调查分析家庭肠外营养病人中感染相关风险因素。研究对象与方法:纳入2018年1月1日在美国宾夕法尼亚大学医院进行HPN服务管理的成年病人,随访至2019年6月30日,使用现有医疗记录收集人口统计学和临床数据。CLABSI报告由传染病专科医生进行前瞻性、独立判断。P<0.05为显着统计学差异,p<0.2的变量纳入多因素Logistic回归模型分析。结果:研究纳入114例进行HPN的病人,平均年龄为54 ± 16岁,女性为68%,平均BMI为25±5.6kg/m2。HPN中位数天数为 516（15-10281）天,26%有CLAB SI既往史。导管类型包括,PICC为72.6%、隧道式为23.9%和Port植入式为3.5%。CLABSI的发生率为0.89/1000导管天数。Logistic回归模型分析结果显示,造口存在（OR=22.0;95%CI,4.8-101.7）、隧道式和 Port植入式导管（OR=4.4;95%CI,1.4-13.9）和BMI<18.5（OR=5.9;95%CI,1.4-24.2）作为血流感染发生的相关风险指标。结论:在成人HPN患者中,造口存在、使用隧道式或植入式导管以及低BMI与CLABSI发生有关。规范化造口护理和营养支持可能有助于降低CLABSI发生。
二、外源精氨酸摄入对移植瘤生长的抑制作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、外源精氨酸摄入对移植瘤生长的抑制作用（论文提纲范文）
（1）抑制脂肪酸合成酶对高脂和高糖膳食诱导的肥胖血糖水平、氧化稳态和代谢的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肥胖 |
| 1.1.1 肥胖概述 |
| 1.1.2 肥胖的诱因 |
| 1.1.3 肥胖的发病机制 |
| 1.1.4 肥胖的主要评判指标 |
| 1.1.5 肥胖的危害 |
| 1.1.6 肥胖的影响因素 |
| 1.1.7 肥胖常见动物模型 |
| 1.2 饮食结构 |
| 1.2.1 我国居民饮食结构的变化 |
| 1.2.2 高碳水化合物饮食和高糖饮食 |
| 1.2.3 高脂饮食 |
| 1.3 肝脏糖代谢和脂代谢 |
| 1.3.1 糖代谢 |
| 1.3.2 脂代谢 |
| 1.4 脂肪酸合成酶 |
| 1.4.1 脂肪酸合成酶概述 |
| 1.4.2 脂肪酸合成酶的作用 |
| 1.4.3 脂肪酸合成酶的抑制剂 |
| 1.4.4 脂肪酸合成酶的研究进展 |
| 1.5 计算机辅助药物设计 |
| 1.5.1 计算机辅助药物设计概述 |
| 1.5.2 计算机辅助药物设计软件MOE简介 |
| 1.5.3 计算机辅助药物设计的优势及应用 |
| 1.6 课题立题依据 |
| 1.7 课题主要研究内容 |
| 第二章 主要供能物质不同的膳食诱导的肥胖小鼠的差异 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验试剂与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验动物和饲料配方 |
| 2.3.2 糖耐量测定 |
| 2.3.3 数据统计与分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 主要供能物质不同的膳食诱导的肥胖小鼠的体重变化 |
| 2.4.2 主要供能物质不同的膳食诱导的肥胖小鼠的血糖变化 |
| 2.4.3 主要供能物质不同的膳食诱导的肥胖小鼠的肠道菌群变化 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 脂肪酸合成酶抑制剂的筛选和功能验证 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 MTT比色法 |
| 3.3.3 耐酸性实验 |
| 3.3.4 Western blot分析 |
| 3.3.5 油红O染色 |
| 3.3.6 移植瘤 |
| 3.3.7 细胞凋亡测定 |
| 3.3.8 免疫组化 |
| 3.3.9 FASN酶活测定 |
| 3.3.10 GC-MS脂肪酸含量测定 |
| 3.3.11 数据统计与分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 FASN在多种组织和细胞系中过表达 |
| 3.4.2 PFI09 能有效抑制多种细胞增殖 |
| 3.4.3 PFI09 能有效抑制脂质合成 |
| 3.4.4 PFI09在KR-domain和 FASN结合 |
| 3.4.5 PFI09 稳定性评估 |
| 3.4.6 改性结构MFI03 能抑制细胞增殖和脂质合成 |
| 3.4.7 MFI03 稳定性评估 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 FASN抑制对高脂和高糖膳食诱导的肥胖小鼠血糖水平和氧化稳态的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 实验试剂与耗材 |
| 4.2.2 实验仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 实验动物和饲料配方 |
| 4.3.2 糖耐量和空腹血糖的测定 |
| 4.3.3 ROS检测 |
| 4.3.4 TBARS测定 |
| 4.3.5 蛋白质羰基的测定 |
| 4.3.6 ELISA |
| 4.3.7 RNA提取与q PCR |
| 4.3.8 还原型谷胱甘肽(GSH)的测定 |
| 4.3.9 数据统计与分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 不同膳食对小鼠肥胖和血糖的影响 |
| 4.4.2 FASN抑制剂对不同膳食诱导的肥胖小鼠体重和脂肪含量的影响 |
| 4.4.3 抑制FASN活性对不同膳食诱导的肥胖小鼠血糖的影响 |
| 4.4.4 抑制FASN活性对不同膳食诱导的肥胖小鼠肝脏的影响 |
| 4.4.5 FASN小分子抑制剂对不同膳食诱导的肥胖小鼠炎症的影响 |
| 4.4.6 FASN小分子抑制剂对氧化还原稳态的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 FASN抑制对高脂和高糖膳食构建的肥胖小鼠肝脏代谢的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与设备 |
| 5.2.1 实验试剂与耗材 |
| 5.2.2 实验仪器与设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 实验动物和饲料配方 |
| 5.3.2 血生化指标测定 |
| 5.3.3 脂质组学测定 |
| 5.3.4 代谢组学测定 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 FASN抑制对小鼠肝脏脂质组成的影响 |
| 5.4.2 FASN抑制对小鼠肝脏脂质组成的影响 |
| 5.4.3 FASN抑制对小鼠肝脏代谢的影响 |
| 5.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ:攻读博士学位期间论文发表及专利申请情况 |
| 附录 Ⅱ:FASN抑制剂的合成及结构鉴定 |
| 附录 Ⅲ:潜在FASN抑制剂的对不同细胞的抑制作用 |
（2）H3R117单ADP核糖基化调节IGFBP1甲基化影响大肠癌脂代谢机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 结直肠癌细胞核单ADP核糖基化水平的分析 |
| 1.实验对象 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 H3R117单ADP核糖基化经IGFBP1对LoVo细胞脂代谢及凋亡的影响 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 H3R117单ADP核糖基化经IGFBP1 影响LoVo细胞脂代谢及凋亡的机制研究 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 PADs介导的瓜氨酸化与肿瘤相关的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士研究生期间发表文章 |
（3）肠内营养中胱/半胱氨酸促进结肠癌生长和耐药的功能和机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1.1 结直肠癌简介 |
| 1.1.1 结直肠癌的基本概况 |
| 1.1.2 结直肠癌的治疗现状 |
| 1.2 癌症患者的营养支持治疗 |
| 1.2.1 肠内外营养支持治疗 |
| 1.2.2 营养干预与肿瘤治疗 |
| 1.3 肿瘤中的氨基酸代谢 |
| 1.3.1 氨基酸代谢在结肠癌中的研究进展 |
| 1.3.2 胱/半胱氨酸在肿瘤中的作用 |
| 1.4 氨基酸调控mTORC1的研究现状 |
| 1.5 氧化应激与肿瘤 |
| 1.6 科学假说与科学问题 |
| 材料与方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 细胞培养、传代、冻存和复苏 |
| 2.1.3 氨基酸饥饿实验 |
| 2.1.4 细胞培养所需实验试剂 |
| 2.2 细胞增殖检测 |
| 2.2.1 SRB实验检测细胞存活 |
| 2.2.2 EdU实验检测细胞DNA合成 |
| 2.3 细胞周期与凋亡检测 |
| 2.3.1 细胞周期检测 |
| 2.3.2 细胞凋亡 |
| 2.4 细胞转染、核质分离与蛋白免疫印迹实验 |
| 2.4.1 siRNA相关信息 |
| 2.4.2 siRNA转染 |
| 2.4.3 裂解细胞提取总蛋白 |
| 2.4.4 蛋白浓度测定 |
| 2.4.5 核质分离 |
| 2.4.6 SDS-PAGE电泳、转膜 |
| 2.4.7 孵育一抗 |
| 2.4.8 孵育二抗和显影 |
| 2.4.9 实验所需仪器设备、抗体和相关试剂信息 |
| 2.5 临床回顾性研究与分析 |
| 2.6 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)与RNA-seq |
| 2.6.1 RNA提取 |
| 2.6.2 RNA反转成c-DNA |
| 2.6.3 实时荧光定量PCR(Real Time PCR,qRT-PCR) |
| 2.6.4 RNA-seq |
| 2.7 ROS和GSH检测 |
| 2.7.1 GSH检测 |
| 2.7.2 ROS检测 |
| 2.8 裸鼠皮下移植瘤实验 |
| 2.8.1 HCT116/RKO荷瘤的结肠癌移植瘤实验 |
| 2.8.2 胱氨酸剥夺/添加的等氮等能氨基酸饮食配方 |
| 2.8.3 靶向代谢组学检测移植瘤中的半胱氨酸水平 |
| 2.9 统计与分析 |
| 结果 |
| 3.1 肠内外营养中胱/半胱氨酸成份促进结肠癌体内外生长 |
| 3.1.1 回顾性队列研究病人临床特征的描述性分析 |
| 3.1.2 肠外营养中半胱氨酸成份降低胃肠道肿瘤患者总生存 |
| 3.1.3 胱氨酸通过SLC7A11转运入细胞促进结肠癌细胞体外生长 |
| 3.1.4 胱氨酸添加饮食促进结肠癌移植瘤生长 |
| 3.1.5 胱氨酸促进结肠癌细胞周期G1-S期转换 |
| 3.1.6 胱氨酸促进结肠癌细胞DNA合成 |
| 3.2 胱氨酸通过激活mTORC1促进结肠癌生长 |
| 3.2.1 阻断GSH合成不能挽救胱氨酸介导的细胞生长 |
| 3.2.2 胱氨酸促进结肠癌细胞mTORC1激活 |
| 3.2.3 抑制mTORC1或敲低mTOR挽救胱氨酸诱导的结肠癌细胞生长 |
| 3.2.4 雷帕霉素阻断胱氨酸添加饮食介导的移植瘤生长 |
| 3.3 胱氨酸通过抑制GCN2-ATF4-SESN2促进mTORC1活化 |
| 3.3.1 胱氨酸下调SESN2的mRNA水平 |
| 3.3.2 胱氨酸通过抑制GCN2-ATF4-SESN2轴信号转导激活mTORC1 |
| 3.4 胱氨酸促进结肠癌发生化疗抵抗 |
| 3.4.1 胱氨酸促进结肠癌细胞抵抗化疗药物的杀伤 |
| 3.4.2 胱氨酸挽救化疗诱导的细胞DNA合成抑制 |
| 3.4.3 胱氨酸降低化疗诱导的细胞凋亡 |
| 3.4.4 胱氨酸部分挽救H_2O_2诱导的细胞死亡 |
| 3.4.5 胱氨酸添加饮食诱导结肠癌移植瘤对奥沙利铂耐药 |
| 3.5 胱氨酸通过清除ROS促进化疗抵抗 |
| 3.5.1 胱氨酸促进GSH合成和清除化疗药物诱导产生的ROS |
| 3.5.2 阻断GSH合成挽救胱氨酸介导的化疗抵抗 |
| 3.5.3 NAC模仿胱氨酸促进结肠癌细胞发生化疗抵抗 |
| 3.5.4 GSH部分模仿胱氨酸促进结肠癌细胞发生化疗抵抗 |
| 3.6 胱氨酸而非亮氨酸、精氨酸或赖氨酸显着增加结肠癌细胞的化疗敏感性 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 氨基酸成份在癌症发生发展与治疗中的研宄进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（4）GTP环化水解酶1在肝癌细胞增殖中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 GTP环化水解酶1(GCH1)在肝细胞癌组织和肝癌细胞中的表达及其临床意义 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 本部分小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 GCH1 沉默促进肝癌细胞的增殖 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 本部分小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 GCH1 沉默的促增殖效应是BH4 合成减少的直接结果 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 本部分小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 GCH1 沉默通过激活ASK1/p38 信号通路来促进肝癌细胞的增殖 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 本部分小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分 O_2~(·-)的增加是GCH1 沉默激活ASK1/p38 信号通路的中间环节 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 本部分小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 脂质代谢重编程与肝细胞癌发生发展的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的学术成果 |
（5）运化毒邪方及其有效成分控制胃癌的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第1章 从毒邪治疗胃癌理论架构 |
| 1.1 毒邪理论治疗肿瘤源流及辨治要法 |
| 1.1.1 毒邪理论治疗肿瘤源流 |
| 1.1.2 毒邪理论辨治肿瘤要法 |
| 1.1.2.1 扶正祛毒 |
| 1.1.2.2 清热解毒 |
| 1.1.2.3 理气排毒 |
| 1.1.2.4 祛瘀化毒 |
| 1.1.2.5 化痰散毒 |
| 1.1.2.6 祛风摄毒 |
| 1.1.2.7 泄浊解毒 |
| 1.1.2.8 安邪休毒 |
| 1.1.2.9 灭虫化毒 |
| 1.1.2.10 以毒攻毒 |
| 1.1.3 小结 |
| 参考文献 |
| 1.2 从“脾主运化”理论探讨胃癌论治 |
| 1.2.1 “脾主运化”藏象理论的渊源 |
| 1.2.2 胃癌重要病机——脾失运化,正虚毒犯 |
| 1.2.3 从“脾主运化”论治胃癌方略 |
| 1.2.3.1 固本祛毒 |
| 1.2.3.2 运化食毒 |
| 1.2.3.3 运化痰毒 |
| 1.2.3.4 运气化毒 |
| 1.2.3.5 其他 |
| 1.2.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第2章 运化毒邪方对进展期胃癌复发转移干预的临床研究 |
| 2.1 资料与方法 |
| 2.1.1 一般资料 |
| 2.1.2 中医肿瘤样本库构建 |
| 2.1.3 研究方法及分组 |
| 2.1.4 临床疗效评定标准 |
| 2.1.5 观察指标 |
| 2.1.6 不良反应观察 |
| 2.1.7 随访方式 |
| 2.1.8 试验监管 |
| 2.1.9 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 数据库构建情况 |
| 2.2.2 病例资料分析描述 |
| 2.2.3 两组临床疗效比较 |
| 2.2.4 两组KPS、ECOG评分和血清肿瘤标记物比较 |
| 2.2.5 两组不良反应比较 |
| 2.2.6 两组一年生存率比较 |
| 2.2.7 单因素分析 |
| 2.2.8 多因素COX比例风险模型分析 |
| 2.2.9 两组无疾病进展生存期比较 |
| 2.2.10 两组血清代谢组学比较 |
| 2.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第3章 运化毒邪方对胃癌生长及介导CLAUDIN-4调控上皮间质转化信号通路的作用 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 药物 |
| 3.1.2 细胞株 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 临床标本 |
| 3.1.5 实验动物 |
| 3.1.6 仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 人胃癌细胞培养 |
| 3.2.2 MTT比色法检测对人胃癌细胞增殖能力的影响 |
| 3.2.3 划痕实验检测细胞迁移 |
| 3.2.4 建立PDTX模型 |
| 3.2.5 动物分组及给药 |
| 3.2.6 肿瘤体积及质量测定 |
| 3.2.7 Western blot检测GSK3β,VEGF-C,Claudin-4蛋白表达 |
| 3.2.8 qPCR检测GSK3β,VEGF-C,Claudin-4 mRNA的表达 |
| 3.2.9 统计学处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 对AGS、BGC-803、SGC-7901细胞增殖的影响 |
| 3.3.2 对AGS、BGC803、SGC7901细胞迁移能力的影响 |
| 3.3.3 PDTX模型成瘤情况 |
| 3.3.4 对移植瘤生长的影响 |
| 3.3.5 对Claudin-4,VEGF-C,GSK3β蛋白表达的影响 |
| 3.3.6 对Claudin-4、VEGF-C、GSK3βmRNA表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第4章 基于高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用技术的运化毒邪方化学成分研究 |
| 4.1 仪器与材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 色谱条件 |
| 4.2.2 质谱条件 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 运化毒邪方化学活性成分检测 |
| 4.3.2 运化毒邪方化学活性成分之一人参皂苷Rg3质谱图信息 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第5章 运化毒邪方主要活性成分之一人参皂苷RG3对胃癌生长及CLAUDIN-4/VEGF-C/GSK3B通路调控作用 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 药物 |
| 5.1.2 细胞株 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 临床标本 |
| 5.1.5 实验动物 |
| 5.1.6 仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 人胃癌细胞培养 |
| 5.2.2 MTT比色法检测对人胃癌细胞增殖能力的影响 |
| 5.2.3 划痕实验检测细胞迁移 |
| 5.2.4 建立PDTX模型 |
| 5.2.5 动物分组及绘药 |
| 5.2.6 肿瘤体积及质量测定 |
| 5.2.7 Western blot检测GSK3β、VEGF-C、Claudin-4蛋白表达 |
| 5.2.8 qPCR检测GSK3β、VEGF-C、Claudin-4 mRNA的表达 |
| 5.2.9 统计学处理 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 对AGS、BGC-803、SGC-7901细胞增殖的影响 |
| 5.3.2 对BGC803、AGS、SGC7901细胞迁移力的影响 |
| 5.3.3 对移植瘤生长的影响 |
| 5.3.4 对Claudin-4/VEGF-C/GSK3β通路蛋白表达的影响 |
| 5.3.5 对Claudin-4/VEGF-C/GSK3β通路mRNA表达的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第6章 VEGFR3靶向性纳米人参皂甙RG3对原位胃癌小鼠移植瘤的影响 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 药物 |
| 6.1.2 细胞株 |
| 6.1.3 主要试剂 |
| 6.1.4 实验动物 |
| 6.1.5 仪器 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 人胃癌细胞培养 |
| 6.2.2 胃癌裸鼠原位荧光移植模型的建立 |
| 6.2.3 动物给药及动态观察 |
| 6.2.4 免疫组化检测 |
| 6.2.5 RT-PCR检测基因表达 |
| 6.2.6 统计学处理 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 对移植瘤生长的影响 |
| 6.3.2 对淋巴结转移的影响 |
| 6.3.3 对VEGF-C/VEDF-D/VEGFR-3通路蛋白表达的影响 |
| 6.3.4 对VEGF-C/VEDF-D/VEGFR-3通路mRNA表达的影响 |
| 6.3.5 对体重和毒性观察 |
| 6.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 综述 肿瘤毒邪论治研宄现状 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间公开发表的论着及取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 研究背景 |
| 1.2.1 细胞凋亡与肿瘤治疗 |
| 1.2.2 可变剪接与肿瘤治疗 |
| 1.2.3 凋亡因子Mcl-1可变剪接与肿瘤 |
| 1.2.4 空间阻滞寡核苷酸应用现状 |
| 1.2.5 小结 |
| 1.3 主要研究内容与研究方案 |
| 1.4 研究意义 |
| 第二章 Mcl-1可变剪接与胃癌的相关性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验仪器和设备 |
| 2.2.2 主要实验试剂 |
| 2.2.3 实验对象 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.2.5 统计方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Mcl-1表达与胃癌的相关性 |
| 2.3.2 Mcl-1 可变剪接异构体mRNA在胃癌组织中的表达 |
| 2.3.3 Mcl-1S和 Mcl-1L mRNA表达与胃癌临床进展的相关性 |
| 2.3.4 胃癌组织Mcl-1L与 Mcl-1S表达的蛋白水平验证 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 SBOs调控Mcl-1 可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验仪器和设备 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.2.3 实验对象 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 胃癌细胞株 Mcl-1L 及 Mcl-1S 基础表达 |
| 3.3.2 空间阻滞寡合苷酸(SBOs)转染效率评价 |
| 3.3.3 SBOs 对 Mcl-1L 及 Mcl-1S 表达的调控作用 |
| 3.3.4 SBOs对胃癌细胞凋亡的诱导作用 |
| 3.3.5 SBOs对胃癌细胞增殖的抑制作用 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 SBOs调控Mcl-1 可变剪接诱导凋亡的体内实验研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验仪器和设备 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.2.3 研究对象 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.3.1 SBOs对裸鼠的毒性反应 |
| 4.3.2 SBOs 治疗对移植瘤体 Mcl-1L 及 Mcl-1S 表达的调控作用 |
| 4.3.3 SBOs 治疗对移植瘤体细胞凋亡的诱导作用 |
| 4.3.4 SBOs 对移植瘤增殖生长的抑制作用 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）肺癌靶向性丝素/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 肺癌抑制基因 |
| 1.2 ING4及IL-24基因的抑癌作用 |
| 1.2.1 ING4基因 |
| 1.2.2 IL-24基因 |
| 1.2.3 ING4及IL-24双基因协同作用 |
| 1.3 ING4及IL-24基因的传递载体 |
| 1.4 腺病毒载体 |
| 1.4.1 腺病毒性质 |
| 1.4.2 腺病毒载体的修饰 |
| 1.5 柞蚕丝素蛋白 |
| 1.5.1 柞蚕丝素蛋白的性质 |
| 1.5.2 柞蚕丝素蛋白应用于基因传递载体 |
| 1.5.3 柞蚕丝素蛋白的阳离子化修饰 |
| 1.6 肺癌细胞的靶向配体 |
| 1.6.1 靶向分子 |
| 1.6.2 靶向肽 |
| 1.7 本文的研究目的及内容 |
| 第二章 ING4-IL-24双基因共表达腺病毒的构建及鉴定 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 溶液、卡那板及凝胶的配制 |
| 2.2.2 双基因重组转移质粒的扩增 |
| 2.2.3 双基因重组转移质粒的PCR鉴定 |
| 2.2.4 同源重组腺病毒质粒的构建 |
| 2.2.5 双基因共表达同源重组腺病毒的包装和扩增 |
| 2.2.6 双基因共表达腺病毒的效价 |
| 2.2.7 双基因共表达腺病毒中ING4基因的表达 |
| 2.2.8 双基因共表达腺病毒中IL-24基因的表达 |
| 2.2.9 数据统计分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 双基因共表达质粒的鉴定 |
| 2.3.2 同源重组腺病毒的构建和鉴定 |
| 2.3.3 腺病毒的包装和扩增 |
| 2.3.4 鉴定同源重组腺病毒中双基因的表达 |
| 2.4 本章结论 |
| 第三章 柞蚕丝素蛋白的阳离子化改性 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 溶液的配制 |
| 3.2.2 柞蚕生丝脱胶 |
| 3.2.3 柞蚕丝素溶解 |
| 3.2.4 柞蚕溶液浓度测定 |
| 3.2.5 PEI改性柞蚕丝素蛋白 |
| 3.2.6 CASF的表面Zeta电位 |
| 3.2.7 CASF的核磁共振氢谱 |
| 3.2.8 CASF的X-射线光电子能谱 |
| 3.2.9 CASF的红外吸收光谱 |
| 3.2.10 Cu~(2+)滴定法测定PEI接枝效率 |
| 3.2.11 CASF溶液粘度 |
| 3.2.12 CASF的圆二色光谱 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 PEI改性柞蚕丝素蛋白的反应过程 |
| 3.3.2 CASF的表面Zeta电位 |
| 3.3.3 CASF的核磁共振氢谱 |
| 3.3.4 CASF的红外吸收光谱 |
| 3.3.5 CASF的X-射线光电子能谱 |
| 3.3.6 PEI接枝柞蚕丝素蛋白的效率 |
| 3.3.7 CASF溶液粘度 |
| 3.3.8 CASF的二级结构 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 阳离子化柞蚕丝素蛋白的肺癌靶向肽修饰 |
| 4.1 实验材料与仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 柞蚕丝脱胶、溶解、浓度测定、阳离子化改性 |
| 4.2.2 靶向肽C_9修饰阳离子化柞蚕丝素蛋白 |
| 4.2.3 CASF-C_9的表面Zeta电位测定 |
| 4.2.4 CASF-C_9的核磁共振氢谱测试 |
| 4.2.5 CASF-C_9的X-射线光电子能谱测试 |
| 4.2.6 CASF-C_9的红外吸收光谱测试 |
| 4.2.7 CASF-C_9的能谱测试 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 寡肽C_9修饰阳离子化柞蚕丝素蛋白 |
| 4.3.2 CASF-C_9的表面Zeta电位 |
| 4.3.3 CASF-C_9的能量色散X-射线光谱 |
| 4.3.4 CASF-C_9的核磁共振氢谱 |
| 4.3.5 CASF-C_9的红外吸收光谱 |
| 4.3.6 CASF-C_9的X-射线光电子能谱 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 CASF-C_9/pDNA复合物对肺癌细胞的靶向生物学效应 |
| 5.1 实验材料与仪器 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 琼脂糖凝胶的配制 |
| 5.2.2 质粒的摇菌、抽提及浓度测定 |
| 5.2.3 CASF-C_9/pDNA复合物的制备 |
| 5.2.4 CASF-C_9/pDNA复合物的琼脂糖凝胶电泳 |
| 5.2.5 CASF-C_9/pDNA复合物的表面Zeta电位 |
| 5.2.6 CASF-C_9/pDNA复合物的形貌及粒径 |
| 5.2.7 CASF-C_9/pDNA复合物转染细胞的绿色荧光表达 |
| 5.2.8 CASF-C_9/pDNA复合物的转染效率 |
| 5.2.9 CASF-C_9/pDNA复合物转染细胞的存活率 |
| 5.2.10 数据统计分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 CASF-C_9/pDNA复合物的琼脂糖凝胶电泳 |
| 5.3.2 CASF-C_9/pDNA复合物的表面Zeta电位 |
| 5.3.3 CASF-C_9/pDNA复合物的形貌及粒径 |
| 5.3.4 CASF-C_9/pDNA复合物转染细胞的荧光表达 |
| 5.3.5 CASF-C_9/pDNA复合物的转染效率 |
| 5.3.6 CASF-C_9/pDNA复合物对细胞增殖的影响 |
| 5.3.7 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 CASF-C_9/Ad复合物的制备及其体外生物学效应 |
| 6.1 实验材料与仪器 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 柞蚕丝的脱胶、溶解、浓度测定、阳离子化改性 |
| 6.2.2 靶向肽修饰阳离子化柞蚕丝素蛋白 |
| 6.2.3 材料与腺病毒的荧光标记 |
| 6.2.4 不同感染复数的腺病毒体外感染细胞 |
| 6.2.5 CASF-C_9/Ad复合物的制备 |
| 6.2.6 CASF-C_9/Ad复合物的表面Zeta电位 |
| 6.2.7 CASF-C_9/Ad复合物的形貌及粒径 |
| 6.2.8 CASF-C_9/Ad复合物的靶向作用 |
| 6.2.9 CASF-C_9/Ad复合物感染细胞的绿色荧光表达 |
| 6.2.10 CASF-C_9/Ad复合物感染细胞的效率 |
| 6.2.11 CASF-C_9/Ad复合物中ING4基因在H460细胞中的表达 |
| 6.2.12 CASF-C_9/Ad复合物中IL-24基因在H460细胞中的表达 |
| 6.2.13 CASF-C_9/Ad复合物感染细胞后的存活率 |
| 6.2.14 CASF-C_9/Ad复合物诱导肺癌细胞凋亡 |
| 6.2.15 数据统计分析 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 不同感染复数的裸腺病毒体外感染细胞 |
| 6.3.2 CASF-C_9/Ad复合物的表面Zeta电位 |
| 6.3.3 CASF-C_9/Ad复合物的形貌及粒径 |
| 6.3.4 CASF-C_9/Ad复合物与细胞共作用 |
| 6.3.5 CASF-C_9/Ad复合物感染细胞的绿色荧光表达 |
| 6.3.6 CASF-C_9/Ad复合物感染细胞的效率 |
| 6.3.7 CASF-C_9/Ad复合物对细胞增殖的影响 |
| 6.3.8 CASF-C_9/Ad复合物中外源性双基因在H460细胞中的表达 |
| 6.3.9 CASF-C_9/Ad复合物诱导肺癌细胞H460凋亡 |
| 6.3.10 讨论 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 CASF-C_9/Ad复合物抑制肺癌移植瘤生长的动物实验 |
| 7.1 实验材料与仪器 |
| 7.1.1 实验材料 |
| 7.1.2 实验仪器 |
| 7.2 实验方法 |
| 7.2.1 柞蚕丝的脱胶、溶解、浓度测定、阳离子化改性 |
| 7.2.2 靶向肽修饰阳离子化柞蚕丝素蛋白 |
| 7.2.3 CASF-C9/Ad复合物的制备 |
| 7.2.4 荷瘤小鼠致瘤所需H460细胞数量试验 |
| 7.2.5 建立小鼠H460肺癌移植瘤 |
| 7.2.6 CASF-C9/Ad复合物治疗肺癌移植瘤 |
| 7.2.7 免疫组化检测 |
| 7.2.8 数据统计分析 |
| 7.3 实验结果 |
| 7.3.1 小鼠移植瘤的致瘤细胞数量 |
| 7.3.2 CASF-C9/Ad复合物的抑瘤作用 |
| 7.3.3 HE染色观察肿瘤组织 |
| 7.3.4 免疫组化检测肿瘤相关因子的表达 |
| 7.3.5 讨论 |
| 7.4 本章小结 |
| 第八章 结语 |
| 8.1 全文结论 |
| 8.2 本论文的主要创新点 |
| 8.3 后续研究计划 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读博士学位期间本人发表的论文及着作 |
| 致谢 |
（8）谷氨酰胺代谢在垂体腺瘤增殖中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一部分 利用生物信息技术整合垂体腺瘤转录数据分析肿瘤代谢紊乱的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果和分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 谷氨酰胺在表达谷氨酰胺合成酶的垂体腺瘤细胞中主要参与核苷酸代谢 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 去除外源性谷氨酰胺对垂体瘤细胞系的影响 |
| 第三章 垂体腺瘤手术标本中GS的表达情况 |
| 第四章 谷氨酰胺剥夺阻滞垂体瘤细胞增殖的机制研究 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述(一) 谷氨酰胺在肿瘤代谢中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述(二) 垂体腺瘤代谢方向的研究现状 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
| 致谢 |
（9）c-Myc通过上调GOT1和Nrf2抵抗肝癌细胞中谷氨酰胺剥夺诱发的铁死亡（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肝癌 |
| 1.1.1 肝癌介绍 |
| 1.1.2 c-Myc |
| 1.1.3 肝癌危险因素 |
| 1.1.4 肝癌治疗 |
| 1.2 谷氨酰胺和肿瘤 |
| 1.2.1 谷氨酰胺的生物学作用 |
| 1.2.2 肿瘤谷氨酰胺代谢 |
| 1.2.3 谷氨酰胺戒断与肿瘤治疗 |
| 1.3 活性氧与肿瘤 |
| 1.3.1 活性氧的产生和清除 |
| 1.3.2 活性氧和肿瘤的关系 |
| 1.4 铁死亡 |
| 第2章 肝癌中谷氨酰胺代谢流向的研究 |
| 2.1 实验仪器和材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 溶液配制 |
| 2.1.5 引物合成序列 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 数据下载 |
| 2.2.2 肝癌组织谷氨酰胺代谢酶类m RNA表达差异分析 |
| 2.2.3 肝癌组织谷氨酰胺代谢酶类m RNA表达与肝癌患者生存期关系分析 |
| 2.2.4 q RT-PCR |
| 2.2.5 数据处理 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 肝癌组织中催化Glu向α-KG转化的酶的表达量减少 |
| 2.3.2 肝癌组织中催化Glu合成GSH的酶的表达量增高 |
| 2.3.3 肝癌细胞吸收代谢谷氨酰胺能力增强 |
| 2.3.4 肝癌细胞系中催化Glu代谢关键酶表达验证 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 谷氨酰胺剥夺对肝癌细胞生存及GSH合成的影响 |
| 3.1 实验仪器和材料 |
| 3.1.1 细胞系 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞计数 |
| 3.2.2 乳酸脱氢酶(LDH)检测 |
| 3.2.3 细胞和组织MDA含量测定 |
| 3.2.4 细胞和组织还原型谷胱甘肽(GSH)含量检测 |
| 3.2.5 细胞和组织谷草转氨酶(GOT1)含量检测 |
| 3.2.6 细胞和组织γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶(GCL)活性检测 |
| 3.2.7 细胞和组织谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性检测 |
| 3.2.8 细胞和组织Glu含量检测 |
| 3.2.9 细胞和组织活性氧ROS含量测定 |
| 3.2.10 q RT-PCR |
| 3.2.11 Western Blot |
| 3.2.12 数据处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 谷氨酰胺剥夺不能完全抑制肝癌细胞存活 |
| 3.3.2 谷氨酰胺剥夺引起肝癌细胞Glu、GSH和MDA的变化 |
| 3.3.3 谷氨酰胺剥夺引起肝癌细胞GSH代偿性合成 |
| 3.3.4 α-KG和Fer-1 促进谷氨酰胺剥夺后肝癌细胞数量增加 |
| 3.3.5 α-KG和Fer-1 抑制谷氨酰胺剥夺引起的肝癌细胞铁死亡 |
| 3.3.6 α-KG或Fer-1 降低了谷氨酰胺剥夺的肝癌细胞ROS水平 |
| 3.3.7 α-KG或Fer-1 促进谷氨酰胺剥夺后肝癌细胞GSH合成 |
| 3.3.8 谷氨酰胺剥夺引起肝癌细胞GOT1表达升高 |
| 3.3.9 谷氨酰胺剥夺诱导半胱氨酸、天冬氨酸和甘氨酸转运体m RNA表达升高 |
| 3.3.10 谷氨酰胺剥夺诱导激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 谷氨酰胺剥夺后肝癌细胞调控GSH合成促进生存的分子机制研究 |
| 4.1 实验仪器和材料 |
| 4.1.1 细胞系 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要试剂 |
| 4.1.5 溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 q RT-PCR |
| 4.2.2 细胞转染 |
| 4.2.3 裸鼠皮下移植瘤 |
| 4.2.4 染色质免疫沉淀(Ch IP)实验 |
| 4.2.5 数据处理 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 谷氨酰胺剥夺诱导c-Myc表达增高 |
| 4.3.2 c-Myc和GOT1的表达具有较强相关性 |
| 4.3.3 沉默c-Myc抑制了GOT1、Nrf2、GCL和GPX4表达 |
| 4.3.4 c-Myc直接结合于GOT1启动区 |
| 4.3.5 沉默c-Myc或GOT1抑制了GSH代偿性合成 |
| 4.3.6 沉默c-Myc抑制了谷氨酰胺剥夺后细胞的存活 |
| 4.3.7 沉默GOT1抑制了谷氨酰胺剥夺后细胞的存活 |
| 4.3.8 沉默c-Myc或GOT1抑制了裸鼠移植瘤 |
| 4.3.9 沉默c-Myc抑制了裸鼠移植瘤GOT1、Nrf2、GCL和GPX4表达 |
| 4.3.10 沉默c-Myc或GOT1抑制裸鼠移植瘤GSH代偿性合成 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）免疫营养干预影响肠道微生态及胃肠肿瘤结局基础与临床初探（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 序言 |
| 第一部分 肠内免疫营养干预在胃癌中对肠道菌群及肿瘤增殖的动物研究初探 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 第一节 动物模型化疗及胃癌移植瘤对肠道菌群的影响 |
| 第二节 免疫营养干预对肠道菌群变化及肿瘤生长的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 肠内营养干预在胃肠肿瘤病人中对肠道菌群及短期临床结局的影响 |
| 前言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三部分 围术期肠内免疫营养干预对胃肠肿瘤临床结局的影响 |
| 前言 |
| 3.1 研究对象与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四部分 胃癌新辅助化疗结合营养支持对长期生存的影响 |
| 4.1 研究对象与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第五部分 长期肠外营养干预中感染相关风险因素的调查分析 |
| 前言 |
| 5.1 研究对象与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 免疫营养在胃肠疾病中对肠道菌群的影响及作用机制 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 纪念615小鼠 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、外源精氨酸摄入对移植瘤生长的抑制作用（论文参考文献）
- [1]抑制脂肪酸合成酶对高脂和高糖膳食诱导的肥胖血糖水平、氧化稳态和代谢的影响[D]. 渠宏雁. 江南大学, 2021(01)
- [2]H3R117单ADP核糖基化调节IGFBP1甲基化影响大肠癌脂代谢机制研究[D]. 王传玲. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]肠内营养中胱/半胱氨酸促进结肠癌生长和耐药的功能和机制研究[D]. 吴皎. 昆明医科大学, 2021
- [4]GTP环化水解酶1在肝癌细胞增殖中的作用及机制研究[D]. 钟国超. 重庆医科大学, 2021(01)
- [5]运化毒邪方及其有效成分控制胃癌的研究[D]. 戴小军. 扬州大学, 2020
- [6]空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究[D]. 李永红. 兰州大学, 2020(04)
- [7]肺癌靶向性丝素/ING4-IL-24双基因共表达腺病毒复合物[D]. 瞿静. 苏州大学, 2020(06)
- [8]谷氨酰胺代谢在垂体腺瘤增殖中的作用及机制研究[D]. 胡锦涛. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
- [9]c-Myc通过上调GOT1和Nrf2抵抗肝癌细胞中谷氨酰胺剥夺诱发的铁死亡[D]. 赵宇翔. 吉林大学, 2020(08)
- [10]免疫营养干预影响肠道微生态及胃肠肿瘤结局基础与临床初探[D]. 薛志刚. 北京协和医学院, 2020(05)