一、SARS冠状病毒M基因片断在大肠杆菌中表达及其抗原性的研究（论文文献综述）
李佳楠[1]（2020）在《传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及其模拟表位的筛选》文中进行了进一步梳理传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）是家禽产业中具有高度传染性的一种病原体,易感染呼吸道,也可引起禽类肾脏和生殖道等疾病,给养禽业造成了严重的经济损失。IBV变异率高且存在多种血清型,各血清型之间几乎没有交叉保护作用,给IBV的诊断和治疗带来了巨大的挑战。S1蛋白作为主要的结构蛋白,负责病毒与宿主细胞膜的结合,能够引起机体产生中和性抗体。因此,抗IBV M41 S1蛋白单克隆抗体（monoclonal antibody,m Ab）的制备和模拟表位的筛选,为IBV的检测打下基础,并为分析S1蛋白抗原表位提供参考。本研究将IBV M41毒株接种鸡胚进行扩繁,从而获得含有病毒的尿囊液。经提取病毒总RNA,RT-PCR方法扩增选定的S1基因,构建重组载体p ET-28a-S1并导入E.coli BL21（DE3）细胞中。诱导表达产物通过SDS-PAGE分析,重组S1蛋白主要以包涵体形式存在,分子量约为20 k Da。复性后的重组S1蛋白经Western-blot验证可以与鸡阳性血清发生反应,表明重组S1蛋白具有反应原性。将重组S1蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠,利用细胞融合技术,获得能稳定分泌抗IBV M41 S1蛋白单克隆抗体的细胞株3D9。间接ELISA方法测定腹水抗体效价可达1:2.56×105,亲和常数为1.7×109L/mol。免疫过氧化物酶单层细胞试验（Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA）结果显示单克隆抗体3D9可以与IBV M41毒株进行反应。以单克隆抗体3D9为靶标,利用噬菌体随机十二肽库进行亲和淘选。通过3轮淘选,对与单克隆抗体3D9特异结合的噬菌体进行测序、鉴定,最终获到IBV M41 S1蛋白的模拟表位为SFYDFEMQGFFI。本研究成功制备抗IBV M41 S1蛋白的单克隆抗体,且可以与IBV M41毒株进行结合,并通过噬菌体展示技术最终筛选到IBV M41 S1蛋白的模拟表位为SFYDFEMQGFFI。
吴雪琼,栾翔凌,熊志红,张俊仙,王宾[2]（2009）在《SARS-CoV E、M和N蛋白克隆、表达及抗原性的研究》文中研究指明目的获得大量SARS-CoV E、M和N重组蛋白,研究其抗原性。方法应用基因工程技术构建pGEX4T-1/SARS-CoV E、M和N大肠杆菌工程菌,表达、纯化重组蛋白,通过Western blot分析其免疫反应性。结果通过PCR扩增获得SARS-CoV E、M、N片断;以原核表达质粒pGEX4T-1为载体,构建了原核表达重组质粒pGEX4T-1/E、pGEX4T-1/M和pGEX4T-1/N。重组N蛋白在大肠杆菌系统中以可溶性形式大量表达,分子量约为71.97kDa。Western blot分析证实,重组N蛋白可与pVAX1-N基因疫苗免疫的小鼠血清产生免疫反应。重组E蛋白和重组M蛋白表达量极低,分子量约为35kDa和46kDa。结论成功地构建了SARS-CoV N大肠杆菌基因工程菌,能以可溶性形式高水平地表达重组N蛋白;该蛋白具有较好的免疫反应性和抗原特异性,可能成为SARS血清学诊断的候选抗原之一。
李建强[3]（2009）在《两种猪腹泻冠状病毒基因组克隆及载体构建》文中提出猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV）均为冠状病毒科（Coronviridae）冠状病毒属（Coronavirus）成员,是引起猪腹泻的重要病原。近年来,国内外对PEDV和TGEV全序列的测定、基因工程疫苗的研究及反向遗传学的研究做了大量工作。本研究以采集的甘肃PEDV DX和TGEV TS毒株为材料,进行了两毒株全基因组的测序、部分基因的表达、真核表达载体的构建和缺陷性病毒载体的构建。其主要结果如下:1.克隆了猪流行性腹泻病毒DX株结构蛋白基因和非结构蛋白基因。分析结果显示DX株S基因、M基因、sM基因和N基因分别为4152、681、231和1326个碱基,聚合酶基因和ORF3基因分别为20354和675个碱基。结构蛋白S基因核苷酸数与英国毒株CV777、中国株JS-2004-2以及韩国株Chujin99相等,均为4152个碱基,比韩国毒株AF500215、AF237764 S基因少9个碱基。同源性分析显示其与中国毒株JS-2004-2关系最为密切。2.构建猪流行性腹泻病毒DX毒株N蛋白基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达出了预期的N蛋白,试验表明其有良好的反应原性。3.分别构建了PEDV和TGEV S和N双基因腺病毒表达载体,转染细胞显示绿色荧光蛋白得以表达,证明目的外源基因可在细胞中表达。4.克隆了猪传染性胃肠炎病毒TS株全基因组。结果表明TGEV TS株全长基因组为28541 bp。其中结构蛋白基因S、sM、M和N分别为4350、246、786和1146碱基,非结构蛋白基因ORF1、ORF3和ORF7分别为20054、1015和237碱基, 5’和3’非编码区分别为319和280碱基。TGEV TS ORF1a和ORF1b蛋白分别由4017和2680个氨基酸组成。进化树分析表明所有TGEV毒株可分为Purdue和Miller亚群,TGEV TS株与Miller亚群进化关系最为相近。5. TGEV TS株在ST、IB-RS-2（IB）和PK-15细胞上传代表明:在该3种细胞连传10代均可出现病变,ST细胞接毒后培养36小时病变特征明显,IB-RS-2和PK-15细胞接毒后48小时病变明显。TGEV TS株在ST细胞接毒后连传10代培养可以用PCR方法检测到3’端基因组,而其在IB和PK-15上接毒后连传10代用PCR方法检测不到3’端基因组。TGEV TS株在PK-15和IB细胞接毒连传50培养,感染PK-15细胞可检测到3’端基因组,而感染IB细胞检测不到3’端基因组。TS株接毒ST和PK-15细胞连传50代培养,PCR扩增3’端基因组发现TS毒株在PK-15细胞传代变异比ST细胞变异大。6.构建TGEV TS缺陷性病毒载体M33,并将绿色荧光蛋白基因插入到载体中,在辅助病毒的作用下转染ST细胞,可观察到荧光蛋白的表达。
葛俊伟[4]（2008）在《猪流行性腹泻病毒主要结构蛋白不同抗原片段在重组干酪乳杆菌中的表达及其免疫学评价》文中研究说明猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是猪的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性传染病。此病多发生于冬季12月至来年2月寒冷季节,在夏季也可发生。哺乳仔猪、断奶仔猪和育肥猪发病率可达100%,成年母猪为15%～19%,以哺乳仔猪受害最严重,死亡率可达95%以上,而成年猪死亡率在10%以下。PEDV主要通过被感染猪只排出的粪便或污染物经口自然感染,新生仔猪潜伏期为24-36小时,肥育猪为2日以上,病猪腹泻开始时排黄色粘稠便,以后变成水样便,腹泻的同时伴有精神沉郁,厌食,消瘦及衰竭。年龄越小,症状越严重,死亡率越高。PED在世界上分布很广,呈现地方性流行性。近年来,流行区域有逐渐扩大的趋势,危害比较严重,给养猪业带来重要经济损失。本研究首先克隆了PEDV LJB/03株s、n基因,并对其分子特征、遗传变异作出分析,结果显示,不同毒株间的变异率很小,表现出了高度的保守性,适合用作基因工程疫苗研究。针对目前PEDV保护性抗原还不清楚的现状,试验中利用实验室构建的重组大肠杆菌,诱导并纯化了PEDV S蛋白的各个片段s1（22-505aa）、S2（488-980aa）、S34（951-1383aa）、PS420（461-638aa）、S22（502-792aa）以及N蛋白,之后利用纯化蛋白免疫试验兔制备高免血清,以高免血清做中和试验,结果显示,除N蛋白外,所有重组蛋白的抗血清的均具有一定的中和活性,中和效价在1:23～1:93之间,其中以S1、S22、PS420的抗血清中和活性较高,分别可达1:93、1:74、1:89;S34中和效价为1:52;S2抗血清中和效价较低,为1:23;抗血清组合后中和效价呈现不同程度的提高,其中以S1、S22、PS420组合抗血清中和活性最好,可达1:363:S1、S2、S34抗血清组合中和活性为1:199,S22与PS420抗血清组合中和活性1:186。从而筛选出适合于基因工程疫苗研究的基因片段。为探讨大肠杆菌不耐热肠毒素B单位（LTB）在乳酸菌传递系统的佐剂活性,并进一步提高PS420的免疫原性,试验中克隆了LTB基因并与ps420基因融合,命名为lp0。以筛选到的免疫保护性抗原蛋白的基因ps1（包含S1、PS420、S22）、ps420、lp0、n为靶基因,分别亚克隆至细胞表面表达型乳酸菌载体pPG-1及分泌表达型乳酸菌载体pPG-2中,电转化后,构建了表达PEDV免疫保护性抗原蛋白的重组干酪乳杆菌表达系统。将获得的8种重组干酪乳杆菌以2%乳糖为诱导剂进行诱导表达。细胞表面表达型重组干酪乳杆菌诱导后经Western blot、间接免疫荧光、全菌体ELISA试验证实,蛋白获得表达,并且定位于干酪乳杆菌菌体表面;分泌表达型重组干酪乳杆菌经诱导后,Western blot、间接ELISA实验表明,重组的目的蛋白获得了分泌表达。为探讨表达重组的重组干酪乳杆菌系统作为活菌疫苗潜在的应用价值,本实验以BALB/c小鼠为实验动物,进行免疫学研究。共分为pPG-1-lp0/L.casei393免疫组、pPG-2-lp0/L.casei393免疫组、pPG-1-ps420/L.casei393免疫组、pPG-2-ps420/L.casei393免疫组、pPG-1-n/L.casei393免疫组、pPG-2-n/L.casei393免疫组、pPG-1-ps1/L.casei393免疫组、pPG-2-ps1/L.casei393免疫组、pPG-1联合免疫组（pPG-1-n/L.casei393、pPG-1-ps1/L.casei393）、pPG-2联合免疫组（pPG-2-n/L.casei393、pPG-2-ps1/L.casei393）、pPG-1/L.casei393免疫对照组、pPG-1/L.casei393免疫对照组、PBS对照组,共13组。口服接种109活菌量,每2周免疫一次,共免疫三次,每次连续免疫3d,一天免疫一次。免疫后分别于0d、7d、21d、35d、49d、63d、77d收集免疫小鼠新鲜粪便、血液、眼冲洗物、鼻腔冲洗液、外生殖道冲洗液等样品。分别测定样品中特异性的sIgA以及小鼠血清中IgG;用MTT法检测免疫小鼠细胞脾淋巴细胞增殖情况,并检测小鼠脾细胞培养上清中细胞因子IL-4、IFN-γ的水平。ELISA检测结果表明,口服免疫重组干酪乳杆菌后在小鼠粪便、眼冲洗液、鼻冲洗液、外生殖道冲洗液、肠黏液中均检测到了特异性sIgA,各组一般在免疫后21d即可产生明显的抗体水平（P＜0.05）,第35d或49d达到sIgA抗体水平最高峰,与和对照组相比,差异均为显着（P＜0.05）或极显着（P＜0.01）,到77d也可检测到抗体存在。同时在小鼠血清中检测到了较高水平的血清抗体,各组一般在免疫后21d即可产生明显的抗体水平（P＜0.05）,第35d或49d达到sIgA抗体水平最高峰,和对照组相比,差异均为显着（P＜0.05）或极显着（P＜0.01）,到77d也可检测到抗体存在。淋巴细胞增殖试验和细胞因子测定结果显示,免疫组可产生明显的细胞免疫应答。口服免疫效果表明,该8种重组干酪乳杆菌表达系统均能刺激动物黏膜免疫应答和系统免疫应答,不但在肠道,而且在眼、鼻、外生殖道等部位均可产生分泌型IgA抗体,并可检测到高水平血清IgG;不仅能诱导体液免疫反应,还可诱导细胞免疫效应。中和试验结果表明,血清抗体、肠粘液sIgA均有一定的保护效果,血清抗体中和效价在1:6～1:93之间,肠黏液IgA中和效价1:3～1:35之间。试验证实细胞表面表达型干酪乳杆菌系统可诱导比分泌表达型干酪乳杆菌系统具有更好的免疫反应;表达ps1基因的重组干酪乳杆菌和表达n基因的重组干酪乳杆菌联合免疫可诱导更强的免疫应答;导向分子LTB的引入增强了重组乳酸菌疫苗的免疫效果,具有佐剂效应。以上结果说明所构建的重组干酪乳杆菌表达系统作为口服疫苗具有潜在的应用价值,为探索新型PED口服疫苗的研制奠定了基础。
张淑霞[5]（2007）在《鸡传染性支气管炎病毒HN99株N、M基因的研究》文中认为鸡传染性支气管炎（IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。IBV主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿生殖系统和消化系统。病鸡出现呼吸困难、产蛋下降、肾炎和腺胃炎等症状和病变。IBV的特点是变异频繁,血清型复杂,所致疾病的临床表现差异很大。常规的诊断方法存在一定的局限性,新的分子生物学诊断方法成为近年来研究的热点。以前,人们对IBV的研究主要集中在S1基因上;但进一步的研究发现,IBV的其他结构蛋白也有重要的生物学功能。近年来,我国鸡传染性支气管炎的流行呈上升趋势,尤其是肾型、腺胃型鸡传染性支气管炎已造成了巨大的经济损失。许多学者认为大量变异株的出现与不规范使用活疫苗有关,但目前有关我国IBV地方流行株的基因序列数据还不够充分,分子生物学方面的研究也还不够深入。为了探索IBV血清型复杂多变的原因及基因工程诊断试剂的研制,本研究对IBV HN99国内分离株的N基因进行了克隆、序列分析、原核表达及表达产物的免疫活性检测;对IBV HN99株的M基因进行了克隆、序列分析及真核表达,为我国IB的诊断及免疫提供科学依据。1.根据GenBank中已发表的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）N基因序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增IBV HN99株的N基因,并将其克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌Top10,提取pMD18-T-N重组质粒,进行酶切和PCR鉴定,并对阳性质粒进行测序,将测序结果与H52、Ark99、BJ等参考毒株进行序列分析。结果表明,N基因全长为1230 bp,编码一条409个氨基酸组成的多肽;其核苷酸与H52,Ark99和BJ等毒株的同源性为88.4%～90.7%,氨基酸同源性为91.7%～94.4%;HN99株与H52,Ark99和BJ等其他各毒株的亲缘关系较远,是一株新的IBV变异株。2.通过RT-PCR扩增HN99株和W株的M基因并测序,将这2个毒株的M基因与GenBank中毒株M基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行比较,并建立M基因系统发育树。结果表明:HN99株M基因全长为669 bp,编码222个氨基酸残基,HN99株存在碱基插入与缺失,而W株M基因全长为681 bp,编码226个氨基酸残基,W株有碱基插入;HN99株与GDS14、M41、Gray、H52、BJ等毒株的M基因核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性分别为87.0%～90.3%和89.7%～94.2%,W株与HN99、M41、Gray、H52、BJ等毒株的M基因核苷酸同源性及其推定的氨基酸分别为88.2%～92.7%和91.1%～95.6%。遗传进化树显示W株与BJ亲缘关系近,HN99株与其他毒株亲缘关系均较远。3.鸡传染性支气管炎病毒HN99株膜蛋白（M）基因PCR产物经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切,克隆入杆状病毒真核表达载体pF-MBP。将构建的重组表达质粒pF–MBP/M转化到DH10BAC-eGFP菌中,然后用脂质体转染法将重组质粒Bacmid-egfp-MBP/M转染Sf9细胞。盲传两代后,倒置显微镜下可见转染的Sf9细胞比正常细胞折光性增强,细胞核增大,细胞增大最后破裂;在荧光显微镜下观察可见细胞浆内有绿色的荧光。提取病变Sf9细胞的DNA,分别用M13引物、特异性引物进行PCR鉴定,从病变细胞中扩增出特异性片段,表明已经产生重组病毒。M基因的表达产物经SDS-PAGE和Western Blot检测结果显示,重组病毒蛋白条带大小约为68 ku,与预期结果一致。4.鸡传染性支气管炎病毒HN99株核蛋白（N）基因PCR产物经BamHⅠ、HindⅢ双酶切,分别克隆入大肠杆菌原核表达载体pMAL?-p2X、pMAL?-c2X、pET28a,构建重组表达载体,经IPTG诱导之后,选择表达量最大的pMAL?-p2X-N做进一步的蛋白纯化、鉴定及表达产物的免疫活性检测。将重组表达质粒pMAL-p2X-N,转化大肠杆菌TB1并进行诱导表达;通过pMAL?融合蛋白纯化系统对表达产物进行非变性纯化,将纯化的N蛋白按常规方法免疫新西兰大白兔,制备兔抗鸡传染性支气管炎病毒N蛋白的多克隆抗体,并用ELISA检测其生物活性。结果表明,重组质粒pMAL?-p2X-N经IPTG诱导,表达的重组核蛋白纯化后相对分子质量分别约为92 ku和82 ku,82 ku的蛋白可能是92 ku蛋白的裂解产物,与Western blot出现的两条蛋白带相一致;纯化的重组蛋白经麦芽糖标签裂解因子作用后,出现两条蛋白带,相对分子质量分别为45 ku和35 ku,说明融合蛋白中的标签已被切除,得到了纯度较高的N蛋白,与预期结果相符合;制备的多克隆抗体可与不同鸡传染性支气管炎病毒株发生反应,与亲本毒株的反应性高于与其他毒株的反应性。综上所述,IBV HN99株N、M基因核苷酸序列均发生了一定程度的变异,与其他参考株亲缘关系均较远,是一株新的IBV变异株。IBV HN99株N基因在原核系统中获得了成功表达,表达的可溶性N蛋白具有高度的生物活性,有望做为新的基因工程抗原用于鸡传染性支气管炎病毒的群特异性诊断;IBV HN99株M基因在带有绿色荧光蛋白标签的真核系统中获得了成功表达;IBV W株M基因存在碱基插入现象,序列发生了变异。本研究为IBV的研究补充了新的试验数据,为预防和控制IB提供了新的资料和科学依据。
邓小敏[6]（2007）在《鸡传染性支气管炎病毒陕西分离株N基因的克隆与分子遗传变异研究》文中研究说明由传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus,IBV）引起的鸡传染性支气管炎（Infectious Bronchitis,IB）是高度传染的全球性鸡病之一,严重危害养鸡业。IBV众多的血清型及其基因组的不断变异给IB的免疫防控带来很大的困难。由IBV变异引起的疫苗免疫失败现象越来越多。IBV N基因及其编码蛋白在病毒RNA的复制、包装、核衣壳的形成、诱导体液免疫和细胞免疫应答等方面有重要意义。本研究对8株IBV陕西分离株的N基因的遗传变异进行了研究,目的是从分子水平上探索我国IB疫苗免疫失败的原因,并对N基因及其编码蛋白在IBV抗体水平监测、诊断和IBV基因工程疫苗等方面的应用进行了初探。研究内容如下:1.用RT-PCR方法对8个IBV陕西分离株（WH、YX、YL、BJ、WG、G5、FF2、B01）的N基因进行了扩增,各扩增产物经克隆、测序后与GenBank登录的7个IBV参考毒株的N基因进行核苷酸序列、氨基酸序列和系统进化树比较分析。结果表明,IBV陕西分离株与参考毒株的同源性差异较大（85.5%～87.3%）,所有分离株N蛋白突变均以散在的点突变形式为主,其变异与组织嗜性无明显相关性;分离株WH、YX和YL与参考毒株Ark99及Gray在同一进化分支上,差异较小;而BJ、WG和G株则形成一个独立的进化分支,与我国疫苗毒株W93、H120及其他参考毒株差异较大;B01株与M41株在进化上接近,与Beaudette株、EP3株在同一进化分支;FF毒株与其他毒株N蛋白差异最大,排在进化树最始端。实验结果提示,我国IBV地方分离株N基因变异有不断加大的趋势。2. IBV陕西分离株G5（W118）已作为我国动物疫苗生产企业--杨凌绿方生物工程有限公司IBV多价灭活苗的制苗毒株之一,该灭活苗对于预防肾变型IB有明显效果。为了从分子水平上揭示W118株的遗传背景和免疫效果,用RT-PCR方法扩增了W118株S1、M和N基因,经克隆和测序后与GenBank登录的IBV参考毒株进行序列比较分析。结果表明,IBV W118株S1基因及N基因与14个参考毒株核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为71.0 %～85.3%和72.7%～83.9%及84.1%～95.7%和88.9%～96.1%,M基因与12个参考毒株核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为86.6%～98.1%和89.8%～98.2%;W118株的S1蛋白与IBV疫苗株H52、H120比较,在25aa位缺失一个氨基酸,73aa位插入了（T-N-G-N-D -V-G）7个氨基酸,其它区域存在多个点突变;S1蛋白潜在糖基化位点分析显示W118株与美国肾型Gray株、英国变异株793B在潜在糖基化位点上有相似性;W118株M蛋白在61aa, 204aa, 222aa出现了点突变,N蛋白在175～241aa抗原区域出现了5个点突变,这可能影响到此抗原区域的B细胞表位。W118株S1、M和N基因的缺失、插入和点突变,揭示了当前IBV弱毒疫苗H120、H52及W93临床保护力差的分子机制。3.运用生物信息软件对IBV W118株N基因蛋白的二级结构特点及抗原性进行了分析。结果表明,IBV W118株N蛋白的氨基酸组成和二级结构特点使其有利于与RNA结合,N蛋白的抗原性好并存在多个B细胞优势表位,与已鉴定的B细胞表位相比位置更明确。构建了W118株N基因原核表达载体N-pET32a,转化并筛选阳性克隆进行诱导表达,SDS- PAGE和Western-blotting检测表明,高量表达的N蛋白具有良好的反应原性,可用于IBV的诊断,为IBV ELISA检测试剂盒的开发提供了材料。4.重新设计一对引物扩增W118株N基因,将其PCR产物连接pMD18-T载体后,切下目的片段插入到复制型DNA疫苗载体pSCA1。BamHⅠ和HindⅢ酶切鉴定和序列测定结果表明,得到了N基因自杀性DNA免疫质粒W118N-pSCA1,这为进一步研究IBV N基因DNA疫苗提供了素材。有关W118株N基因自杀性DNA疫苗与S1基因的DNA疫苗或IBV分离株灭活苗的联合应用正在试验之中。从本研究的结果来看,8株IBV陕西分离毒N基因核苷酸及氨基酸序列均发生了一定的变异,并与我国疫苗株H120、H52和W93有较大差异,这也许是近年来我国IB疫苗免疫失败的原因之一。IBV W118株主要结构基因（特别是S1基因）的序列分析,揭示了其作为灭活苗制苗毒株能有效预防肾型IBV地方流行强毒株的分子机制以及H120、H52和W93弱毒株在IB临床免疫预防上的缺陷。本研究不仅为新型IBV基因工程疫苗的开发提供了理论依据,而且也丰富了我国IBV的分子流行病学资料。
殷华平[7]（2007）在《传染性胃肠炎病毒基因组大片段克隆及其主要抗原片段在伪狂犬病病毒中的表达》文中提出传染性胃肠炎病毒属于冠状病毒科，主要引起猪的肠炎和严重的腹泻，新生仔猪的感染将导致严重的的死亡，给养猪业造成了巨大的危害和经济损失。TGEV基因组为单股正链RNA，具有感染性，全长约28.5 kb，5’端20kb序列编码病毒的复制酶多聚蛋白，3’端约8.3 kb编码4种结构蛋白（S、sM、M、N）和4种非结构蛋白，这些蛋白在病毒的生活周期中都具有重要的作用。其中S蛋白具有重要的生物学功能：携带有主要的B淋巴细胞抗原决定簇，是唯一能诱导机体产生中和抗体和提供免疫保护作用的结构蛋白；含有宿主细胞氨肽酶的受体识别位点，决定其宿主组织细胞亲嗜性；是决定TGEV的毒力的基因之一；具有细胞膜融合作用，协助病毒从细胞核蛋白进入细胞浆；具有血凝活性区。目前，TGEV部分基因的功能还不完全清楚，因此本文拟通过RT-PCR的方法扩增获得TGEV的全长cDNA片段，并分段克隆大片段cDNA，为后期进行感染性克隆、基因功能研究、致病机制和疫苗的开发打下坚实的基础，也为冠状病毒特别SARS等的研究提供参考。参考GenBank登陆的TGEV序列，设计了6对引物，以抽提的TGEV细胞毒总RNA为模板，分段扩增获得了TGEV-31、TGEV-32、TGEV-33、TGEV-34、TGEV-35、TGEV-36共6段PCR产物，其大小分别为1.5kb、2.0kb、1.1kb、1.4kb、1.4kb、1.3kb，扩增片段与pGM-T载体连接获得了pGMT-31、pGMT-32、pGMT-33、pGMT-34、pGMT-35、pGMT-36共6个克隆，分别克隆了1456bp、1957bp、1079bp、1362bp、142bp、1327bp的TGEV cDNA片段，经生物信息学软件拼接共获得了TGEV 3’8495bp的序列。基于TGEV S、M、sM、N、Nsp3a、Nsp3b、Nsp7的进化树分析表明，TGEV与TS、HN2002、T014、TS、PURDUE等毒株具有非常近的亲缘关系。为了获得TGEV的全长cDNA，参考NCBI登陆的TGEV病毒的序列，设计了7对引物，以抽提的TGEV细胞毒的总RNA为模板，分段扩增获得了TGEV-A、TGEV-B、TGEV-Cl（mu）、TGEV-C2（mu）、TGEV-DE、TGEV-F6片段PCR产物，其大小分别为6.2kb、5.3kb、2.3kb、3.0kb、6.9kb、5.1kb。通过点突变的方法运用，以TGEV-Cl（mu）、TGEV-C2（mu）为模版，重叠PCR法扩增出了TGEV-C片段，其大小为5.3kb。TGEV-A、TGEV-B、TGEV-C、TGEV-DE、TGEV-F五个cDNA大片段，分别与pGM-T载体连接，结果仅成功克隆了其中的TGEV-A、TGEV-B、TGEV-F三个片段，分别命名为pTA-A、pTA-B、pGM-T。为了在原核细胞和真核细胞中进行S基因主要抗原片段的表达，设计一对引物从TGEV细胞毒RNA中扩增出了包含S基因主要抗原的片段，分别连接pET32a（+）、pET28a（+）和pEGFP-Cl表达载体，获得重组质粒pET32a-S、pET28a-S、pEGFPCI-S，并在大场杆菌和Vero细胞中分别进行了原核和真核的表达，结果pET32a-S、pET28a-S在Ecoli BL21细胞中未能获得良好表达，而pEGFPCl-S在Vero细胞中成功地获得了表达。为了构建表达TGEV S基因主要抗原片段的PRV重组病毒，PCR扩增了S基因主要抗原片段，并克隆到已经构建成功的绿色荧光蛋白转移载体pPPI2．EGFP中，命名为pPPI2．EGFP．S，采用磷酸钙法将pPPI2．EGFP．S与SA215病毒基因组DNA共转染Vero细胞，结果在12小时以后可以观察到绿色荧光，24～48小时荧光到达最大量，48小时后荧光开始衰退，细胞在转染48小时后开始出现病变，96小时后细胞75％出现病变；在96小时后可以看见出现发生重组的绿色荧光病变细胞，挑取病灶反复纯化几次，获得了表达S基因主要抗原片断重组病毒PRV SA215-S，抽提病毒基因组DNA，PCR扩增能够从中扩增出大小为1.7kb的S基因主要抗原片段。应用生物信息学软件分析了PRV和TGEV全基因序列的密码子偏爱性，分别计算了其RSCU、Nc、GC、GC3s、双核苷酸组成，根据计算的结果运用GC3s-Nc分布图、GC12-GC3s散点图、对应分析解析了TGEV和PRV密码子用法发生偏爱的主要影响因素，结果表明，PRV主要偏爱于使用以G和C结尾的密码子，而TGEV则主要使用以A和U结尾的密码子，影响PRV密码子偏爱G、C的主要因素是碱基组成限制、碱基突变、翻译选择和基因功能，TGEV的影响因素则只有碱基组成限制、碱基突变，翻译选择对其密码子的用法无影响。
周生[8]（2007）在《禽传染性支气管炎病毒分离株的全基因组及S1、M、N基因DNA疫苗研究》文中研究说明禽传染性支气管炎（IB）呈世界广泛流行，是危害养鸡生产最严重的病毒性传染病之一。由于禽传染性支气管炎病毒（IBV）很容易发生变异，导致新的变异株不断出现，且不同毒株之间交叉保护力弱，使该病经常在免疫和非免疫的禽群爆发，造成了严重的经济损失。在前期工作基础上，本研究对IBV肾型分离株SAIBk株的全基因组和11株分离株的3′端非编码区进行了序列测定和分析，并进一步构建了SAIBk株S1、M、N基因的荧光融合表达质粒并在细胞中进行表达研究，在此基础上构建了S1、M、N基因的真核表达质粒并对其免疫原性进行了比较研究，为从分子水平研究IBV的流行进化及研制预防和控制IB的DNA疫苗奠定基础。1．选择具有一定代表性的IBV致肾病变型分离株SAIBk株，采用RT-PCR方法将其基因组分19个片段进行了扩增、测序及分析。结果表明：SAIBk株能引起鸡胚矮化，形成侏儒胚；其病毒经蔗糖密度梯度离心纯化后，在电镜下可观察到典型的冠状病毒粒子；SAIBk株基因组全长27520bp，核苷酸组成中A+T的含量占61.74％；具有典型的冠状病毒基因组结构，其528-20410位为RNA依赖的RNA聚合酶基因，编码两个多聚蛋白ORF1a和ORF1b，20361-27155位主要编码病毒的各种结构蛋白，包括S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白；SAIBk株与Beaudette、Mass41、Ca199、BJ、KQ6基因组序列的同源率介于85.6％-87.6％之间；不同区域的同源性比较结果表明，3′UTR和5′UTR是基因组中最为保守的区域，同源率介于90％-98％之间，而S1基因是基因组中变异最大的区域，同源率介于74.8％-83.2％之间。本试验在国内外首次对IBV肾型分离株的基因组全序列进行了测定，丰富了冠状病毒的生物信息数据库，为进一步研究该病的分子流行病学和DNA疫苗奠定了基础。2．选择11株IBV分离株，采用RT-PCR方法对其3′端非编码区进行了测序及分析。结果表明：11株分离株3′端非编码区的PCR扩增片断长度介于328bp—512bp之间；将11株分离株与Genbank上登录的15个毒株的序列进行比较分析，表明3′非编码区存在大量的碱基插入和缺失，不同毒株之间碱基数目最大相差208bp；根据不同毒株在3′非编码区片段的大小，可以将26个毒株分成4组；26株毒株3′非编码区的进化树分析结果与按照3′非编码区片段大小进行分组有较一致的结果。其中的基因Ⅰ型和基因Ⅱ型毒株均属于第二组，基因Ⅲ型毒株属于第三组，基因Ⅳ型毒株属于第四组，而第一组的毒株均为国外分离毒株。本试验通过测定11株IBV分离株3′端非编码区的序列，为IBV分离株的分子流行病学研究提供科学依据。3．构建S1、M和N基因的荧光融合表达质粒，转染Vero细胞后观察结构蛋白在细胞内的表达与分布。结果表明：酶切分析和测序结果证明构建了融合表达质粒pS1-EGFP、pM-EGFP、pN-EGFP、pS1-DsRed、pM-DsRed、pN-DsRed；在S1、M、N结构蛋白上均未分析出有核定位信号；转染了pS1-EGFP、pS1-DsRed质粒的Vero细胞，细胞的胞浆和胞核区均显示出绿色荧光或红色荧光，荧光的强度随着转染时间的增加而增强；pM-EGFP、pM-DsRed质粒转染的Vero细胞，激发的绿色和红色荧光仅分布在胞浆区域，且分布不均匀，表明pM-EGFP、pM-DsRed质粒表达的M-EGFP和M-DsRed在胞浆中发生了聚集；pN-EGFP、pN-DsRed质粒表达的融合蛋白在胞浆区域或胞核区域发生了部分聚集。本试验首次构建了S1、M和N基因的荧光融合表达质粒并在细胞中进行了表达研究，为进一步研制的IBV DNA疫苗提供了理论基础。4．选择高效的真核表达载体pcDNA3.1（+），将分离株SAIBk株的S1、M、N基因分别插入其多克隆位点，构建真核表达质粒pIBVS1、pIBVM和pIBVN，对构建的表达质粒进行酶切和测序鉴定，用脂质体转染Vero细胞，进行蛋白的表达和鉴定。结果表明：酶切和DNA测序证实重组质粒pIBVS1、pIBVM、pIBVN构建正确；通过RT-PCR、间接免疫荧光检测证实IBV的S1、M、N基因能在细胞中正确的转录和表达。本试验构建了S1、M和N基因的真核表达质粒，并在细胞中进行了表达检测，为进一步的DNA疫苗免疫试验提供了材料。5．将构建的pIBVS1、pIBVM和pIBVN质粒单独或按比例混合进行动物免疫试验。结果表明：雏鸡免疫pIBVS1、pIBVM和pIBVN质粒后，均能产生特异性抗体，对强毒的攻击具有一定的保护力，其中pIBVM的保护率为37.5％；将pIBVS1、pIBVM和pIBVN质粒混合免疫所产生的抗体水平和对强毒攻击的保护力，均要优于单基因的效果；将三基因混合的质粒以脂质体为佐剂进行免疫原性研究，在试验期间脂质体包裹DNA疫苗组与裸质粒疫苗组的抗体水平差异不显着，但前者的抗体水平一直要高于后者；脂质体包裹DNA疫苗组的外周血CD4+T、CD8+T淋巴细胞数量要显着高于裸质粒疫苗组，两者差异显着（P＜0.05）或极显着（P＜0.01）；在攻毒保护率上，脂质体包裹DNA疫苗组的保护率为72.7％，要优于三基因混合裸质粒DNA疫苗组的54.5％。本研究首次在国内外对M基因及S1、M、N基因混合DNA疫苗的免疫原性进行了比较研究，研制出脂质体包裹的三基因混合DNA疫苗，对有效的预防和控制IB的流行具有重要的意义。
朱函坪[9]（2007）在《汉坦病毒N蛋白的重组表达及其IgM直接捕捉ELISA的建立和应用》文中提出肾综合征出血热（HFRS）是由汉坦病毒（Hantavirus，HV）引起的一组急性病毒性传染病，临床上以发热、出血及肾损害为主的一种自然疫源性疾病。全世界均有流行，我国是高发区，约占世界发病总数的90％以上，全国30个省市自治区均有本病的流行，近十年来，年报告发病人数4～6万人。汉坦病毒在全世界广泛分布，自1976年分离到该病毒以来，不断有新的汉坦病毒被发现，到目前已有28个汉坦病毒血清型／基因型。我国至少存在2个血清型，即HTN型（姬鼠型）和SEO型（家鼠型）。小型啮齿类动物为本病毒的主要贮存宿主，不同的汉坦病毒有不同的贮存宿主，黑线姬鼠为姬鼠型病毒的主要宿主，常引起重型出血热，病死率约为3～5％；褐家鼠为家鼠型病毒的主要宿主，常引起轻型出血热，病死率约为1％。本病主要通过接触带病毒的宿主动物及其排泄物受感染。HV属布尼亚病毒科（Bunyaviridae），是一种有包膜病毒，其基因组为单股负链RNA，含大（L）、中（M）、小（S）3个基因片段，分别编码多聚酶（polymerase）、包膜糖蛋白（glycoprotein）G1和G2、核蛋白（nucleocapsid protein，NP）。S基因长全约1.6～1.8Kb，3’与5’端各有一个非编码区，只有一个开放读码框架，编码一个分子量在48～50kD的核蛋白。尽管RT-PCR能检测汉坦病毒特异性核酸，可用于HFRS的早期诊断，但由于急性期患者病毒血症持续时间短、滴度低而难以检出，故检测特异性抗体的血清学检查，仍是目前HFRS的主要确诊方法。目前血清学检测所用抗原主要是由病毒感染细胞后收获制备而成，由于汉坦病毒具有较强的传染性，培养病毒需要在生物安全实验中进行，加上病毒在细胞中繁殖滴度低，难以获得大量的病毒抗原。研究发现HV病毒感染机体后，首先诱导产生较高水平的IgM抗体，随后产生IgG抗体，而早期抗体主要是由NP诱导产生的。因此，许多国内、外学者构建了多种表达系统来表达NP，作为HFRS的血清学诊断抗原。目前所用HFRS血清学试验，主要是基于病毒或表达核蛋白为抗原的IgM捕捉ELISA，此法有四个主要步骤，操作烦琐、费时。因此，建立快速、简便、安全、敏感和特异的HFRS血清学诊断新方法有重要意义。本研究以含有生产肾综合征出血热疫苗的Z10毒株全长S基因的质粒为模板，通过高保真PCR亚克隆S基因核蛋白编码区，通过序列测定，分析它与国内外汉坦病毒分离株的同源性，以确定它的代表性。构建Z10株NP原核表达系统pET28a-Z10N-E.coli BL21DE3，表达重组核蛋白（rNP）。ELISA法检测表达情况，通过离子交换法和Ni-NTA亲和层析法提纯rNP，SDS-PAGE了解rNP纯化情况，Western blot检测rNP的特异性免疫反应。并以提纯的重组NP为抗原，直接标记辣根过氧化酶（HRP），建立IgM直接捕捉ELISA。通过检测95份HFRS患者血清（临床表现典型，经传统的免疫荧光法证实）及部分健康者血清，与HV为抗原的常规IgM捕捉ELISA法进行比较，符合率为97.78％，两种IgM捕捉ELISAs法的阳性率分别为94.73％和92.63％，表明快速、简便、安全的rNP-IgM直接捕捉ELISA与HV-IgM间接捕捉ELISA对HFRS患者血清样品具有相同的检测效果。
吴琼[10]（2007）在《SARS病毒S1蛋白活性片段在原核中的表达和纯化》文中指出随着严重急性呼吸道综合征（severe acute respiratory syndrome, SARS）的出现,对SARS冠状病毒（SARS coronavirus, SARS-CoV）的研究已取得了突飞猛进的发展。许多研究表明SARS-CoV的S蛋白（spike protein）在病毒的感染过程中起了重要作用,它在病毒与宿主细胞表面受体结合及导膜融合进入细胞的过程中,起关键的作用,是冠状病毒的主要抗原。人们发现冠状病毒S蛋白可以分为S1和S2两部分,其中S1是参与冠状病毒识别细胞受体的主要部分,是SARS-CoV与细胞受体结合的部位。因此,本课题主要是对S1进行研究。我们利用Nco I和HindⅢ两种酶对pcDNA3-S1质粒进行双酶切,获得目的基因片段,再将目的基因片段与用相同酶切的pPelB质粒载体连接,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,然后在适宜条件下用IPTG诱导可溶性表达。收集菌体,利用SDS-PAGE和Western blot进行初步鉴定,并进行了免疫学活性检测。在验证了表达产物具有活性后进行大量表达,所获得的产物利用金属螯合亲和层析进行纯化。结果表明我们成功地在大肠杆菌中表达了S1蛋白片段并可以利用金属螯合亲和层析纯化方法对表达产物进行纯化,得到相对较纯的重组蛋白。
二、SARS冠状病毒M基因片断在大肠杆菌中表达及其抗原性的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、SARS冠状病毒M基因片断在大肠杆菌中表达及其抗原性的研究（论文提纲范文）
（1）传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及其模拟表位的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 IBV感染临床症状及流行概况 |
| 1.1.1 临床症状 |
| 1.1.2 流行概况 |
| 1.2 IBV病原学概述 |
| 1.2.1 IBV的结构特征 |
| 1.2.2 IBV的理化特性 |
| 1.2.3 IBV的体外培养 |
| 1.2.4 IBV基因组结构 |
| 1.3 IBV结构蛋白及生物学功能 |
| 1.3.1 S(纤突)蛋白 |
| 1.3.2 M蛋白 |
| 1.3.3 N蛋白 |
| 1.3.4 E蛋白 |
| 1.4 IBV的诊断 |
| 1.4.1 血清学诊断 |
| 1.4.2 分子生物学诊断 |
| 1.5 IBVS1蛋白单克隆抗体制备及表位研究进展 |
| 1.5.1 单克隆抗体技术研究进展 |
| 1.5.2 IBVS1蛋白的表位研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 2 IBVM41S1蛋白的表达、纯化及鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 毒株和鸡胚 |
| 2.1.2 实验主要仪器及设备 |
| 2.1.3 实验主要试剂和耗材 |
| 2.1.4 实验试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 IBVM41毒株的扩繁 |
| 2.2.2 IBV M41总RNA的提取 |
| 2.2.3 cDNA的合成 |
| 2.2.4 引物设计 |
| 2.2.5 PCR扩增S1基因 |
| 2.2.6 PCR产物的纯化回收 |
| 2.2.7 pMD19-T-S1的构建 |
| 2.2.8 重组载体pET-28a-S1的构建 |
| 2.2.9 重组S1蛋白的表达 |
| 2.2.10 重组S1蛋白的可溶性分析 |
| 2.2.11 SDS-PAGE |
| 2.2.12 纯化重组S1蛋白 |
| 2.2.13 Western-blot |
| 2.2.14 重组S1蛋白的浓度测定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 S1基因的扩增 |
| 2.3.2 pMD19-T-S1载体的构建 |
| 2.3.3 表达载体pET-28a-S1的构建 |
| 2.3.4 S1重组蛋白的表达与可溶性分析 |
| 2.3.5 重组S1 蛋白的复性及Western-blot验证 |
| 2.3.6 重组S1蛋白的浓度测定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 S1蛋白抗原区的选择 |
| 2.4.2 表达载体的选择 |
| 2.4.3 蛋白的变性和复性 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 抗IBVM41S1蛋白单克隆抗体的制备和鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物和细胞 |
| 3.1.2 实验主要仪器及设备 |
| 3.1.3 实验主要试剂及耗材 |
| 3.1.4 试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 动物免疫 |
| 3.2.2 小鼠血清效价的测定 |
| 3.2.3 SP2/0细胞的培养 |
| 3.2.4 饲养细胞的制备 |
| 3.2.5 脾细胞的制备 |
| 3.2.6 细胞融合 |
| 3.2.7 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 3.2.8 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 3.2.9 杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
| 3.2.10 单抗腹水制备与纯化 |
| 3.2.11 单抗浓度及纯度的测定 |
| 3.2.12 单抗效价及亲和力的测定 |
| 3.2.13 单抗与IBVM41毒株的反应 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 免疫小鼠血清效价的测定 |
| 3.3.2 阳性杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.3.3 单抗浓度与纯度的鉴定 |
| 3.3.4 单抗效价的测定 |
| 3.3.5 单抗亲和力的测定 |
| 3.3.6 单抗与IBVM41毒株的反应 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 IBVM41S1蛋白模拟表位的筛选 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验主要仪器及设备 |
| 4.1.2 实验主要试剂及耗材 |
| 4.1.3 试剂的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 第一轮亲和淘选 |
| 4.2.2 噬菌体的扩增与纯化 |
| 4.2.3 测定洗脱产物和扩增产物的滴度 |
| 4.2.4 第二、三轮噬菌体的淘选 |
| 4.2.5 噬菌斑的扩增与纯化 |
| 4.2.6 阳性噬菌体的鉴定 |
| 4.2.7 阳性噬菌体测序及序列分析 |
| 4.2.8 间接竞争ELISA |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 亲和淘选噬菌体的富集 |
| 4.3.2 阳性噬菌体的鉴定 |
| 4.3.3 噬菌体模拟表位分析 |
| 4.3.4 间接竞争ELISA |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 去污剂浓度、单抗纯度和包被浓度 |
| 4.4.2 模拟表位分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩写词汇表 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（3）两种猪腹泻冠状病毒基因组克隆及载体构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩写词英汉对照表 |
| 前言 |
| 第一章 猪流行性腹泻病毒DX 株全基因组的克隆分析与N 蛋白的原核表达 |
| 第一节 猪流行性腹泻病毒结构蛋白基因的克隆与特征分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 试验方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.2.1 PEDV DX 结构蛋白基因的RT-PCR 扩增 |
| 1.2.2 PCR 产物的克隆与鉴定 |
| 1.2.3 核苷酸序列的测定 |
| 1.2.4 PEDV S 基因的序列及其特性分析 |
| 1.2.5 PEDV M 基因的序列及其特性分析 |
| 1.2.6 PEDV N 基因的序列及其特性分析 |
| 1.2.7 PEDV sM 基因的序列及其特性分析 |
| 1.3 讨论 |
| 第二节 猪流行性腹泻病毒聚合酶及ORF3 的克隆与特征分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 PEDV DX ORF1 及ORF3 基因的RT-PCR 扩增 |
| 2.2.2 PCR 产物的克隆与鉴定 |
| 2.2.3 序列的测定及拼接 |
| 2.2.4 DX 株聚合酶基因的序列比较及其特性分析 |
| 2.2.5 PEDV DX 株ORF3 序列及其特性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三节 猪流行性腹泻病毒DX 株N 蛋白的原核表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 N 基因的RT-PCR 扩增及鉴定 |
| 3.2.2 重组表达质粒的鉴定 |
| 3.2.3 SDS-PAGE 电泳 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 猪流行性腹泻病毒S+N 基因腺病毒表达载体的构建 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 毒株与细胞 |
| 1.2 载体及菌株 |
| 1.3 工具酶及其它试剂盒 |
| 1.4 细胞培养 |
| 1.5 病毒RNA 的提取 |
| 1.6 S 中和抗原位点和N 基因的制备 |
| 1.7 S 中和抗原位点片段和N 基因的连接 |
| 1.8 重组腺病毒穿梭载体的构建 |
| 1.9 同源重组用线性化重组腺病毒穿梭载体的获得 |
| 1.10 AdEasier-1 BJ5183 菌细菌感受态的制备 |
| 1.11 电转化 AdEasier-1 BJ5183 细菌感受态细胞 |
| 1.12 复制缺陷型重组腺病毒质粒的鉴定 |
| 1.13 用重组腺病毒质粒转化宿主菌 DH10B |
| 1.14 转染AD-293 细胞获得重组腺病毒 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 S 中和抗原位点和N 基因的扩增和鉴定 |
| 2.2 S 中和抗原位点和N 基因在pQIC-X 载体上的连接及鉴定 |
| 2.3 重组腺病毒穿梭载体的构建 |
| 2.4 获得复制缺陷型腺病毒质粒 |
| 2.5 重组腺病毒的收获及鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 猪传染性胃肠炎病毒TS 株全基因特征及在不同细胞上的传代特性 |
| 第一节 猪传染性胃肠炎病毒TS 株结构蛋白基因的克隆及特性分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 试验方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.2.1 TGEV TS 株S、sM、M 和N 的RT-PCR 扩增 |
| 1.2.2 PCR 产物的克隆与鉴定 |
| 1.2.3 序列的测定及拼接 |
| 1.2.4 TS 株结构蛋白基因的序列比较及其特性分析 |
| 1.3 讨论 |
| 第二节 猪传染性胃肠炎病毒TS 株非结构蛋白基因及非编码区的克隆及特性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 TGEV TS ORF1、ORF3 和ORF7 的RT-PCR 扩增 |
| 2.2.2 PCR 产物的克隆与鉴定 |
| 2.2.3 序列的测定及拼接 |
| 2.2.4 TS 株结构蛋白基因的序列比较及其特性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三节 猪传染性胃肠炎病毒在不同细胞传代的特性 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 PK-15 细胞胰酶耐受性 |
| 3.2.2 TGEV 在不同细胞中的传代 |
| 3.2.3 TGEV 传代不同细胞50 代3’基因组的克隆 |
| 3.2.4 TGEV TS 在ST 细胞和PK-15 细胞培养50 代后3’基因的序列分析 |
| 3.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 猪传染性胃肠炎病毒S+N 基因腺病毒表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 毒株与细胞 |
| 1.1.2 载体及菌株 |
| 1.1.3 工具酶及其它试剂盒 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 病毒RNA 的提取 |
| 1.2.3 S 中和抗原位点和N 基因的制备 |
| 1.2.4 TGEV S 基因 AD 抗原位点片段和N 基因的连接 |
| 1.2.5 含感受态细胞的准备 |
| 1.2.6 重组腺病毒穿梭载体的构建 |
| 1.2.7 重组腺病毒质粒的构建 |
| 1.2.8 转染AD-293 细胞获得重组腺病毒 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 TGEV TS S AD 位点和N 基因的RT-PCR 扩增 |
| 2.2 S AD 位点和N 基因在pQICX 载体上的连接及鉴定 |
| 2.3 重组腺病毒穿梭载体的构建 |
| 2.4 获得复制缺陷型腺病毒质粒 |
| 2.5 重组腺病毒的收获及鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 表达绿色荧光蛋白猪传染性胃肠炎缺陷性病毒载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 病毒的增殖与收获 |
| 1.2.2 病毒RNA 的提取 |
| 1.2.3 引物的设计与合成 |
| 1.2.4 RT-PCR 扩增 |
| 1.2.5 PCR 产物的纯化回收 |
| 1.2.6 连接反应 |
| 1.2.7 连接反应 |
| 1.2.8 感受态细胞的制备 |
| 1.2.9 转化 |
| 1.2.10 质粒DNA 的提取 |
| 1.2.11 重组质粒的酶切鉴定 |
| 1.2.12 重组质粒PCR 鉴定 |
| 1.2.13 pSL1180 载体的改造和鉴定 |
| 1.2.14 pSL-M33 载体的构建和鉴定 |
| 1.2.15 表达荧光蛋白的pSL-M33-GFP 载体的构建和鉴定 |
| 1.2.16 缺陷性病毒荧光蛋白的表达 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 构建缺陷性病毒载体片段的克隆 |
| 2.2 构建缺陷性病毒载体片段的鉴定 |
| 2.3 构建缺陷性病毒载体片段的鉴定 |
| 2.3.1 pSL1180-CMV-BGH 载体的鉴定 |
| 2.3.2 pSL1180-M33 载体的构建及鉴定 |
| 2.3.3 pSL1180-M33 荧光表达载体的构建及鉴定 |
| 2.4 缺陷性病毒载体在辅助病毒作用下荧光的表达 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 猪流行性腹泻病毒分子生物学研究进展 |
| 1 一般生物学特性 |
| 2 基因组结构及表达方式 |
| 3 基因及其蛋白的研究 |
| 3.1 聚合酶基因 |
| 3.2 S 基因 |
| 3.3 开放阅读框架ORF3 |
| 3.4 sM (small membrane) 基因 |
| 3.5 M (membrane) 基因 |
| 3.6 N (nucleocapsid) 基因 |
| 4 PEDV 分子生物学检测 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 第七章 猪传染性胃肠炎病毒分子生物学研究进展 |
| 1 一般生物学特性 |
| 2 基因组结构及表达方式 |
| 3 基因及其蛋白的研究 |
| 3.1 S 基因 |
| 3.2 M 基因 |
| 3.3 N 基因 |
| 3.4 sM 基因 |
| 3.5 基因1 |
| 3.6 基因3 |
| 3.7 基因7 |
| 3.8 非编码区 |
| 4 感染性cDNA 的研究 |
| 5 TGEV 的组织嗜性 |
| 6 TGEV 的变异性和免疫 |
| 7 TGEV 分子生物学检测技术 |
| 8 展望 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 附录 |
| 附录1 TGEV TS 全基因组核苷酸序列（Genbank: DQ201447） |
| 附录2 PEDV DX 结构蛋白和ORF3 核苷酸序列(Genbank:EU031893) |
| 附录3 PEDV DX 非结构蛋白ORF1 核苷酸序列 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
（4）猪流行性腹泻病毒主要结构蛋白不同抗原片段在重组干酪乳杆菌中的表达及其免疫学评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.引言 |
| 1.1 研究的目的和意义 |
| 1.2 猪流行性腹泻的流行与危害 |
| 1.3 PEDV的病原学特征 |
| 1.3.1 PEDV的分类地位与生物学特征 |
| 1.3.2 PEDV的病原性 |
| 1.3.3 PEDV的分子生物学特征 |
| 1.3.4 PEDV的受体研究 |
| 1.3.5 PEDV的抗原表位研究 |
| 1.4 PEDV的免疫学研究概况 |
| 1.4.1 PEDV感染仔猪的免疫反应 |
| 1.4.2 PEDV感染后的抗体产生及其保护作用 |
| 1.4.3 PED疫苗的研究 |
| 1.5 乳酸杆菌表达外源抗原研究进展 |
| 1.5.1 乳酸杆菌受体系统 |
| 1.5.2 乳酸杆菌的益生作用 |
| 1.5.3 乳酸杆菌作为抗原表达载体的优势 |
| 1.5.4 乳酸杆菌与黏膜免疫 |
| 1.5.5 乳酸杆菌表达抗原及免疫效果 |
| 1.5.6 乳酸杆菌口服疫苗展望 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒与细胞 |
| 2.1.2 菌种与质粒 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.1.6 试验动物 |
| 2.1.7 血清 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 n和s基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 全长s基因的获得 |
| 2.2.3 PEDV N蛋白和S蛋白的免疫原性分析 |
| 2.2.4 分子佐剂LTB基因的克隆及其与ps420基因串联 |
| 2.2.5 表达不同基因片段的重组干酪乳杆菌的构建 |
| 2.2.6 免疫效果评价 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 RT-PCR结果 |
| 3.2 测序结果与序列分析 |
| 3.3 s基因克隆结果 |
| 3.4 大肠杆菌中外源蛋白表达及纯化 |
| 3.5 抗血清滴度检测 |
| 3.6 中和试验 |
| 3.7 重组表达载体的鉴定 |
| 3.8 重组乳杆菌的表达鉴定 |
| 3.8.1 细胞表面表达型重组干酪乳杆菌的诱导表达鉴定结果 |
| 3.8.2 分泌表达型重组干酪乳杆菌的诱导表达鉴定结果 |
| 3.9 免疫小鼠后特异性抗体检测结果 |
| 3.9.1 小鼠血清中特异性IgG检测结果 |
| 3.9.2 免疫小鼠鼻冲洗液中特异性sIgA检测结果 |
| 3.9.3 免疫小鼠粪便中特异性sIgA检测结果 |
| 3.9.4 免疫小鼠外生殖道冲洗液中特异性sIgA检测结果 |
| 3.9.5 免疫小鼠眼冲洗液中特异性sIgA检测结果 |
| 3.9.6 肠粘液中特异性sIgA检测结果 |
| 3.10 特异性淋巴细胞增殖试验 |
| 3.11 细胞因子测定结果 |
| 3.12 口服重组干酪乳杆菌免疫小鼠所获得的血清抗体及肠黏液抗体中和试验结果 |
| 4.讨论 |
| 4.1 PEDV LJB/03株s和n基因的分子特征 |
| 4.2 课题设计思路 |
| 4.3 PEDV抗原片段筛选及其意义 |
| 4.4 表达不同抗原片段的重组乳酸杆菌的免疫效果分析 |
| 4.5 提高乳酸杆菌转化效率的关键技术 |
| 5.结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（5）鸡传染性支气管炎病毒HN99株N、M基因的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 鸡传染性支气管炎研究进展 |
| 1.1 IB 病原学研究 |
| 1.1.1 病原分类 |
| 1.1.2 血清型 |
| 1.1.3 理化特性 |
| 1.1.4 培养特性 |
| 1.1.5 生物学活性 |
| 1.2 IB 的流行病学 |
| 1.3 IB 的临床症状 |
| 1.4 IB 的病理变化 |
| 1.5 IB 的诊断 |
| 1.5.1 IBV 的分离鉴定 |
| 1.5.2 IBV 的血清学诊断 |
| 1.5.3 IBV 的分子生物学诊断 |
| 1.6 IB 的防治技术 |
| 1.6.1 疫苗 |
| 1.6.2 免疫接种 |
| 1.6.3 综合措施 |
| 第二章 鸡传染性支气管炎病毒分子生物学研究进展 |
| 2.1 IBV 的基因组结构 |
| 2.2 IBV 的合成 |
| 2.2.1 IBV 基因组RNA 的复制与转录 |
| 2.2.2 IBV 病毒粒子的装配、运输与出芽 |
| 2.3 IBV 结构蛋白 |
| 2.3.1 纤突（S）蛋白 |
| 2.3.2 膜（M）蛋白 |
| 2.3.3 核（N）蛋白 |
| 2.3.4 小膜蛋白（sM 蛋白或3c 蛋白或E 蛋白） |
| 2.4 IBV 非结构蛋白 |
| 2.5 IBV 的遗传变异 |
| 2.5.1 IBV 分子遗传变异的机理 |
| 2.5.2 IBV 分子遗传变异的影响因素 |
| 第三章鸡传染性支气管炎病毒N、M 基因及其编码蛋白的研究进展 |
| 3.1 编码IBV N 蛋白的MRNA 结构特征 |
| 3.2 IBV N 蛋白的生物学功能 |
| 3.3 IBV N 蛋白遗传变异 |
| 3.4 N 基因的免疫原性 |
| 3.4.1 IBV 抗原表位在N 蛋白上的定位 |
| 3.4.2 IBV N 蛋白与免疫 |
| 3.4.3 N 基因的原核与真核表达及表达蛋白的免疫原性 |
| 3.5 IBV N 基因及其编码产物在诊断中的应用 |
| 3.5.1 IBV N 基因在诊断中的应用 |
| 3.5.2 N 蛋白及其单抗在诊断中的应用 |
| 3.6 IBV M 基因及编码的M 蛋白结构特征与功能 |
| 3.7 IBV M 蛋白遗传变异 |
| 3.8 IBV M 蛋白与免疫 |
| 3.9 IBV M 蛋白单克隆抗体研究 |
| 第四章鸡传染性支气管炎病毒HN99 株N 基因的克隆及分子遗传变异分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株 |
| 4.1.2 SPF 鸡胚 |
| 4.1.3 载体与菌株 |
| 4.1.4 工具酶与试剂 |
| 4.1.5 引物 |
| 4.1.6 IBV 参考毒株名称及GenBank 登录号 |
| 4.1.7 培养基的配制 |
| 4.1.8 常用溶液的配制 |
| 4.1.9 小量碱裂解法制备质粒所用溶液 |
| 4.1.10 琼脂糖凝胶电泳所用溶液 |
| 4.1.11 其它溶液的配制 |
| 4.1.12 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 IBV HN99 株病毒增殖与RNA 的提取 |
| 4.2.2 RT-PCR 扩增IBV HN99 株N 基因片段 |
| 4.2.3 PCR 产物的回收、纯化与克隆 |
| 4.2.4 转化 |
| 4.2.5 碱裂解法提取质粒pMD18-T-N |
| 4.2.6 重组质粒pMD18-T-N 的PCR 及双酶切鉴定 |
| 4.2.7 遗传变异分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 HN99 株N 基因的扩增 |
| 4.3.2 pMD18-T-N 重组质粒鉴定 |
| 4.3.3 IBV HN99 株N 基因的核苷酸序列测定 |
| 4.3.4 IBV 不同毒株N 基因的同源性分析 |
| 4.3.5 IBV HN99 株N 基因的遗传变异分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 鸡传染性支气管炎病毒HN99 株、W 株M 基因的克隆及分子遗传变异分析 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 毒株 |
| 5.1.2 SPF 鸡胚 |
| 5.1.3 载体与菌株 |
| 5.1.4 工具酶与试剂 |
| 5.1.5 引物 |
| 5.1.6 IBV M 基因参考毒株名称及GenBank 登录号 |
| 5.1.7 培养基的配制及常用溶液的配制 |
| 5.1.8 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 IBV HN99 株、W 株病毒增殖与RNA 的提取 |
| 5.2.2 RT-PCR 扩增IBV HN99 株、W 株M 基因片段 |
| 5.2.3 M 基因PCR 产物的回收、纯化与克隆 |
| 5.2.4 转化 |
| 5.2.5 重组质粒pMD18-T-M(HN99)、pMD18-T-M(W)的提取 |
| 5.2.6 阳性重组子的PCR 及双酶切鉴定 |
| 5.2.7 M 基因测序 |
| 5.2.8 遗传变异分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 HN99 株、W 株M 基因的扩增 |
| 5.3.2 重组质粒pMD18-T-M(HN99)、pMD18-T-M(W)鉴定 |
| 5.3.3 IBV HN99 株、W 株M 基因的核苷酸序列测定 |
| 5.3.4 IBV 不同毒株M 基因的同源性分析 |
| 5.3.5 IBV HN99 株、W 株M 基因的遗传变异分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章鸡传染性支气管炎HN99 株M 基因在昆虫-杆状病毒系统中的表达 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 引物设计与合成 |
| 6.1.2 载体和菌株 |
| 6.1.3 细胞系及其培养基 |
| 6.1.4 酶和其他分子生物学试剂 |
| 6.1.5 M13 通用引物 |
| 6.1.6 细菌培养基 |
| 6.1.7 主要仪器设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 杆状病毒Bac to Bac 表达系统操作流程 |
| 6.2.2 Bacmid-egfp 的构建流程 |
| 6.2.3 IBV HN99 株M 基因的PCR 扩增及产物回收 |
| 6.2.4 重组质粒pFBDM-MBP/M（简称pF-MBP/M）的构建 |
| 6.2.5 转座 |
| 6.2.6 重组转座子的鉴定 |
| 6.2.7 转染 |
| 6.2.8 重组病毒的鉴定 |
| 6.2.9 蛋白质的SDS-PAGE 凝胶电泳 |
| 6.2.10 重组蛋白Western Blot 检测 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 pF-MBP/M 质粒的筛选与酶切鉴定 |
| 6.3.2 重组转座子PCR 鉴定 |
| 6.3.3 转染后细胞病变及绿色荧光观察 |
| 6.3.4 重组杆状病毒的PCR 鉴定 |
| 6.3.5 表达产物的SDS-PAGE 和Western Blot 分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章鸡传染性支气管炎病毒HN99 株N 基因在大肠杆菌中的表达及产物免疫活性检测 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 毒株、血清及实验动物 |
| 7.1.2 引物设计与合成 |
| 7.1.3 载体、菌株及质粒 |
| 7.1.4 主要试剂 |
| 7.1.5 蛋白非变性纯化所用主要溶液 |
| 7.1.6 ELISA 和western blot 所用主要溶液 |
| 7.1.7 主要仪器 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 IBV HN99 N 基因的PCR 扩增及产物回收 |
| 7.2.2 重组表达载体的构建 |
| 7.2.3 重组质粒在大肠杆菌中的表达及鉴定 |
| 7.2.4 IBV HN99 核蛋白的纯化 |
| 7.2.5 核蛋白多克隆抗体的制备 |
| 7.2.6 核蛋白多克隆抗体与不同IBV 的反应性 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 重组质粒的构建及鉴定 |
| 7.3.2 重组核蛋白基因的表达和鉴定 |
| 7.3.3 IBN HN99 核蛋白的纯化 |
| 7.3.4 IBN HN99 核蛋白多克隆抗体与不同IBV 的反应性 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）鸡传染性支气管炎病毒陕西分离株N基因的克隆与分子遗传变异研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 鸡传染性支气管炎病毒分子生物学及核蛋白研究进展 |
| 1.1 IBV 分类地位及形态特征 |
| 1.2 IBV 基因组 |
| 1.2.1 S 基因 |
| 1.2.2 M 基因 |
| 1.2.3 非结构域 |
| 1.3 N 基因研究进展 |
| 1.3.1 N 基因遗传变异研究 |
| 1.3.2 N 蛋白的结构特征 |
| 1.3.3 N 蛋白的生物学功能 |
| 1.3.4 N 蛋白的免疫学特性研究 |
| 1.3.5 N 蛋白与IBV 基因工程疫苗 |
| 1.3.6 N 蛋白在血清抗体水平监测中的应用 |
| 1.3.7 N 蛋白单克隆抗体研究 |
| 1.4 结语 |
| 第二章 鸡传染性支气管炎病毒陕西分离株N 基因的克隆及分子遗传变异分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株 |
| 2.1.2 载体及菌种 |
| 2.1.3 试剂及溶液配制 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 IBV 各分离毒株的引物设计 |
| 2.2.2 病毒增殖 |
| 2.2.3 病毒总RNA 提取 |
| 2.2.4 分离株 N 基因 RT-PCR |
| 2.2.5 RT-PCR 产物的纯化回收 |
| 2.2.6 RT-PCR 产物与T 载体连接 |
| 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.8 转化 |
| 2.2.9 重组质粒的提取 |
| 2.2.10 IBV 分离株N 基因重组质粒的鉴定 |
| 2.2.11 各分离株N 基因序列测定与测定结果的鉴定 |
| 2.2.12 IBV 分离株N 基因核苷酸序列及推导氨基酸序列分析 |
| 2.2.13 IBV 分离株N 基因系统发生进化关系分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 各毒株N 基因扩增结果 |
| 2.3.2 N 基因克隆筛选的限制性酶切鉴定结果 |
| 2.3.3 各毒株N 基因序列测定结果 |
| 2.3.4 参考毒株在GenBank 中的登录号 |
| 2.3.5 各毒株N 基因与参考毒株核苷酸序列及氨基酸推导序列同源性比对 |
| 2.3.6 IBV 分离株的N 蛋白氨基酸变异特征分析 |
| 2.3.7 IBV 分离株的N 基因系统发生进化关系分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 鸡肾型传染性支气管炎病毒W118 株主要结构基因的分子遗传特征 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 毒株 |
| 3.1.2 载体及菌种 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 引物设计 |
| 3.1.5 病毒RNA 提取及RT-PCR |
| 3.1.6 IBV W118 株S1、M 和N 基因克隆与鉴定 |
| 3.1.7 IBV W118 株S1、M 和N 基因序列测定 |
| 3.1.8 S1、M 和N 基因推倒氨基酸序列分析 |
| 3.1.9 S1、M 和N 基因与参考毒株序列比较及系统发生进化关系分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 IBV W118 株S1、M 和N 基因的扩增、克隆及鉴定 |
| 3.2.2 IBV W118 株S1、M 和N 基因的核苷酸序列测定 |
| 3.2.3 W118 株S1、M 和N 基因的分子特征及与参考毒株的比较分析 |
| 3.2.4 IBV W118 株与参考毒株S1 基因的同源性比较与进化树分析 |
| 3.2.5 IBV W118 株与参考毒株M 基因的同源性比较与系统进化分析 |
| 3.2.6 IBV W118 株与参考毒株N 基因的同源性比较与进化树分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 W118 株S1、M 和N 基因变异特点 |
| 3.2.2 W118 株与其它参考毒株的可能关系、可能来源及研究意义 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 传染性支气管炎病毒W118 株N 蛋白在大肠杆菌中的表达及其结构预测分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株和质粒 |
| 4.1.2 酶与试剂 |
| 4.1.3 阳性血清及酶标抗体 |
| 4.1.4 W118 株N 蛋白二级结构预测和抗原表位分析 |
| 4.1.5 引物的设计与合成 |
| 4.1.6 N 基因的扩增与pMD18-T 载体连接 |
| 4.1.7 原核重组表达载体的构建与鉴定 |
| 4.1.8 N 蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 4.1.9 表达蛋白的鉴定 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 W118 株N 蛋白二级结构和抗原表位 |
| 4.2.2 重组原核表达载体N-pET32a 的酶切鉴定 |
| 4.2.3 重组原核表达载体序列测定 |
| 4.2.4 表达蛋白的SDS-PAGE 检测 |
| 4.2.5 表达蛋白的Western-blot 检测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 鸡传染性支气管炎病毒W118株N基因自杀性DNA免疫质粒的构建 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 质粒及菌株 |
| 5.1.2 酶与试剂 |
| 5.1.3 引物的设计与合成 |
| 5.1.4 N 基因的扩增与pMD18-T 载体连接 |
| 5.1.5 N 基因DNA 免疫质粒的构建 |
| 5.1.6 N 基因DNA 免疫质粒序列测定 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 N 基因的扩增 |
| 5.2.2 N 基因重组质粒的酶切鉴定 |
| 5.2.3 N 基因DNA 免疫质粒的酶切鉴定 |
| 5.2.4 N 基因DNA 免疫质粒的测序鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（7）传染性胃肠炎病毒基因组大片段克隆及其主要抗原片段在伪狂犬病病毒中的表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.TGEV的分子生物学研究概况 |
| 1.1 传染性胃肠炎病毒基因组学 |
| 1.2 TGEV蛋白结构和功能 |
| 1.3 TGEV变异性及致病性研究概况 |
| 1.4 TGEV反向遗传研究概况 |
| 1.5 对传染性胃肠炎进一步研究的展望 |
| 2.伪狂犬病病毒基因缺失病毒及其表达载体研究进展 |
| 3.本研究的目的和意义 |
| 第二章 传染性胃肠炎病毒3′端8.5kb片段的克隆及序列分析 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 病毒RNA的提取 |
| 1.4 TGEV 3′端8.5 kb片断分段扩增 |
| 1.5 TGEV 3′端8.5kb片断分段克隆 |
| 1.6 TGEV 3′端8.5 kb片断序列特征分析 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 TGEV 3′端片断的分段RT-PCR扩增 |
| 2.2 TGEV 3′端片断的分段克隆 |
| 2.3 TGEV 3′端片断序列的生物信息学分析 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第三章 传染性胃肠炎病毒大片段的扩增与克隆 |
| 1.材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 引物的设计与合成 |
| 1.3 病毒RNA的提取 |
| 1.4 TGEV-A、TGEV-B、TGEV-C、TGEV-DE和TGEV-F 5个片段RT-PCR扩增 |
| 1.5 TGEV-A、TGEV-B和TGEV-F 3个片段的克隆 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 TGEV-A片段的RT-PCR扩增 |
| 2.2 TGEV-B片段的RT-PCR扩增 |
| 2.3 TGEV-C片段的RT-PCR扩增 |
| 2.4 TGEV-DE片段的RT-PCR扩增 |
| 2.5 TGEV-F片段的RT-PCR扩增 |
| 2.6 TGEV-A片段的克隆 |
| 2.7 TGEV-B片段的克隆 |
| 2.8 TGEV-F片段的克隆 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四章 传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原片断的原核表达和真核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 S基因主要抗原片段在原核表达载体pET32a(+)、pET28a(+)中的表达 |
| 1.3 S基因主要抗原片段在Vero细胞中的表达 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 S基因主要抗原片段在pET32a(+)载体中的原核表达 |
| 2.2 S基因主要抗原片段在pET28a(+)载体中的原核表达 |
| 2.3 S基因主要抗原片段在Vero细胞中的真核表达 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第五章 传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原片段在伪狂犬病病毒中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 含传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原片段的伪狂犬病病毒转移载体的构建 |
| 1.3 TGEV S基因主要抗原片段与伪狂犬病病毒基因缺失疫苗株SA215的同源重组及表达 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 含传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原片段的伪狂犬病病毒转移载体的构建 |
| 2.2 pPPI2.EGFP.S11#与SA215的同源重组 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第六章 传染性胃肠炎病毒与伪狂犬病病毒全基因组密码子用法特点分析 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料和软件 |
| 1.2 实验方法步骤 |
| 2.结果与分析 |
| 2.1 TGEV和PRV分析的编码序列 |
| 2.2 PRV SA215株病毒gD基因序列的测定 |
| 2.3 PRV和TGEV RSCU值、Nc值、GC、GC_(3S)等各项参数的计算 |
| 2.4 影响PRV和TGEV密码子偏向性因素初步分析 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（8）禽传染性支气管炎病毒分离株的全基因组及S1、M、N基因DNA疫苗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 禽传染性支气管炎概述 |
| 前期工作基础 |
| 存在的问题 |
| 本研究的意义 |
| 第一章 IBV肾型分离株SAIBk株全基因组序列测定与分析 |
| 摘要 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 IBV肾型分离株和鸡胚 |
| 2.1.2 宿主菌、质粒和分子生物学试剂 |
| 2.1.3 生化试剂 |
| 2.1.4 器皿及试剂处理 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒培养及致鸡胚病变观察 |
| 2.2.2 病毒的纯化及电镜观察 |
| 2.2.3 病毒RNA提取 |
| 2.2.4 SAIBk株基因组的RT-PCR分段扩增 |
| 2.2.5 3′-RACE获取基因组3′末端片断 |
| 2.2.6 5′-RACE获取基因组5′末端片断 |
| 2.2.7 RT-PCR产物的克隆 |
| 2.2.8 重组质粒的序列测定 |
| 2.2.9 基因组全序列的生物信息学分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 SAIBk株的致鸡胚病变 |
| 3.2 病毒的纯化及电镜观察 |
| 3.3 SAIBk株基因组RT-PCR分段扩增结果 |
| 3.4 3′-RACE和5′-RACE获取病毒基因组末端片断结果 |
| 3.5 RT-PCR产物的克隆和序列测定结果 |
| 3.6 基因组全序列的生物信息学分析结果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 病毒的电镜观察 |
| 4.2 SAIBk株基因组的分段扩增 |
| 4.3 SAIBk株基因组的生物信息学分析 |
| 5. 小结 |
| 第二章 11株IBV分离株3′非编码区序列的测定与分析 |
| 摘要 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 种毒和鸡胚 |
| 2.1.2 宿主菌、质粒和分子生物学试剂 |
| 2.1.3 生化试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的增殖 |
| 2.2.2 病毒RNA提取 |
| 2.2.3 引物的设计与合成 |
| 2.2.4 3′非编码区的RT-PCR扩增 |
| 2.2.5 3′非编码区产物的克隆 |
| 2.2.6 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.7 重组质粒的序列测定 |
| 2.2.8 3′非编码区的序列分析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 3′非编码区序列的RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 3′非编码区的序列测定和基本特性分析 |
| 3.3 3′非编码区序列的同源性分析 |
| 3.4 3′非编码区核苷酸序列的进化树分析 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 IBV 3′非编码区的特征 |
| 4.2 3′非编码区的序列分析 |
| 5. 小结 |
| 第三章 S1、M、N基因荧光融合表达质粒的构建及表达研究 |
| 摘要 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒、细胞株、质粒和宿主菌 |
| 2.1.2 工具酶及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒RNA提取 |
| 2.2.2 S1、M、N基因的RT-PCR扩增 |
| 2.2.3 S1、M、N基因荧光融合表达质粒的构建与鉴定 |
| 2.2.4 S1、M、N蛋白的定位序列分析 |
| 2.2.5 荧光融合表达质粒的转染和表达检测 |
| 3. 结果 |
| 3.1 S1、M、N基因的RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 S1、M、N基因融合表达质粒的酶切鉴定 |
| 3.3 S1、M、N基因融合表达质粒的测序鉴定 |
| 3.4 S1、M、N蛋白的定位序列分析结果 |
| 3.5 荧光融合表达质粒在细胞中的表达结果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 报告基因的选择 |
| 4.2 核定位信号分析 |
| 4.3 S1、M、N基因在细胞中的表达 |
| 5. 小结 |
| 第四章 SAIBk株S1、M、N基因真核表达质粒的构建 |
| 摘要 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、宿主菌和细胞株 |
| 2.1.2 工具酶及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 S1、M、N基因的PCR扩增 |
| 2.2.2 S1、M、N基因真核表达质粒的构建 |
| 2.2.3 S1、M、N基因真核表达质粒的鉴定 |
| 2.2.4 真核表达质粒的表达检测 |
| 3. 结果 |
| 3.1 S1、M、N基因的PCR扩增结果 |
| 3.2 S1、M、N基因真核表达质粒的鉴定 |
| 3.3 真核表达质粒的表达检测结果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 目的基因的选择 |
| 4.2 载体的选择 |
| 4.3 真核表达质粒的转染 |
| 4.4 真核表达质粒表达产物的检测 |
| 5. 小结 |
| 第五章 SAIBk株S1、M、N基因DNA疫苗的制备和免疫原性研究 |
| 摘要 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 质粒、实验动物和攻毒用毒株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 质粒的制备与纯化 |
| 2.2.2 脂质体的制备 |
| 2.2.3 疫苗的配制 |
| 2.2.4 S1、M、N基因DNA疫苗的免疫原性比较研究 |
| 2.2.5 脂质体包裹的三基因混合DNA疫苗的免疫原性研究 |
| 3. 结果 |
| 3.1 质粒的制备与鉴定 |
| 3.2 脂质体及疫苗的制备结果 |
| 3.3 S1、M、N基因DNA疫苗的免疫原性比较结果 |
| 3.4 脂质体包裹的三基因混合DNA疫苗的免疫原性比较结果 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 S1、M、N单基因DNA疫苗的免疫原性 |
| 4.2 三基因混合DNA疫苗的免疫原性 |
| 4.3 脂质体包裹的三基因混合DNA疫苗的免疫原性 |
| 4.4 DNA疫苗的免疫反应与攻毒保护 |
| 5. 小结 |
| 结论 |
| 文献综述 |
| (一) IB的概述 |
| (二) IBV的分子生物学研究进展 |
| (三) IB的疫苗及佐剂研究 |
| (四) DNA疫苗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录1. 英汉缩略名词对照表 |
| 附录2. SAIBk株的全基因序列 |
| 在读期间发表的论文、论着及获奖情况 |
（9）汉坦病毒N蛋白的重组表达及其IgM直接捕捉ELISA的建立和应用（论文提纲范文）
| 一、中文摘要 |
| 二、英文摘要 |
| 三、论文正文 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 四、结论 |
| 五、综述 |
| 六、已发表的文章 |
| 七、致谢 |
（10）SARS病毒S1蛋白活性片段在原核中的表达和纯化（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 序论 |
| 1. 冠状病毒概述 |
| 2. SARS 病毒概述 |
| 3. S蛋白研究现状 |
| 4. 蛋白表达系统 |
| 5. 蛋白质的纯化 |
| 6. 立题目的与意义 |
| 第二章 SARS 病毒 S1 蛋白活性片段的表达 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三章 SARS 病毒 S1 蛋白活性片段的纯化 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 致谢 |
四、SARS冠状病毒M基因片断在大肠杆菌中表达及其抗原性的研究（论文参考文献）
- [1]传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及其模拟表位的筛选[D]. 李佳楠. 郑州大学, 2020(02)
- [2]SARS-CoV E、M和N蛋白克隆、表达及抗原性的研究[J]. 吴雪琼,栾翔凌,熊志红,张俊仙,王宾. 中国现代医学杂志, 2009(22)
- [3]两种猪腹泻冠状病毒基因组克隆及载体构建[D]. 李建强. 甘肃农业大学, 2009(06)
- [4]猪流行性腹泻病毒主要结构蛋白不同抗原片段在重组干酪乳杆菌中的表达及其免疫学评价[D]. 葛俊伟. 东北农业大学, 2008(03)
- [5]鸡传染性支气管炎病毒HN99株N、M基因的研究[D]. 张淑霞. 西北农林科技大学, 2007(01)
- [6]鸡传染性支气管炎病毒陕西分离株N基因的克隆与分子遗传变异研究[D]. 邓小敏. 西北农林科技大学, 2007(06)
- [7]传染性胃肠炎病毒基因组大片段克隆及其主要抗原片段在伪狂犬病病毒中的表达[D]. 殷华平. 四川农业大学, 2007(02)
- [8]禽传染性支气管炎病毒分离株的全基因组及S1、M、N基因DNA疫苗研究[D]. 周生. 四川农业大学, 2007(02)
- [9]汉坦病毒N蛋白的重组表达及其IgM直接捕捉ELISA的建立和应用[D]. 朱函坪. 浙江大学, 2007(02)
- [10]SARS病毒S1蛋白活性片段在原核中的表达和纯化[D]. 吴琼. 吉林大学, 2007(03)