一、猪γ-干扰素双顺反子表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达（论文文献综述）
孙曼曼,高雄,方求武,严豪,刘秀霞,杨艳坤,白仲虎[1]（2020）在《谷氨酸棒杆菌增强型表达载体构建及牛α-干扰素表达》文中研究表明谷氨酸棒杆菌是一种传统的食品级工业微生物,近年来正逐渐被开发成为一种新型的无内毒素重组蛋白表达宿主。为提高其外源蛋白的表达能力,将内源双顺反子元件引入到穿梭载体pXMJ19的多克隆位点之前,得到含有增强型Ptac启动子的谷氨酸棒杆菌表达载体pSM19,该载体以EGFP作为报告基因,相比出发载体表达量提高了99.5%。将密码子优化的,带有组氨酸标签的牛α-干扰素成熟蛋白编码基因合成并克隆到pSM19载体中,转化谷氨酸棒杆菌表达菌株Corynebacterium glutamicum CGMCC1.15647中进行诱导表达。培养温度为30℃时,重组牛α-干扰素蛋白大部分以包涵体形式存在,而16℃培养时的蛋白可溶性有较大改善。在5 L发酵罐中进行放大培养,得到大量表达重组牛α-干扰素的菌体,并用镍柱进行了简单纯化,产量预估为68 mg/L菌液。利用MDBK-VSV系统对重组牛α-干扰素进行生物学活性测定,其抗病毒效价为（1.35±0.23）×106 U/mg。
张伟[2]（2019）在《谷氨酸棒杆菌外源蛋白分泌表达系统的开发及其应用研究》文中进行了进一步梳理谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）是一种高GC含量的革兰氏阳性菌,属于GRAS。除作为氨基酸和有机酸等的生产菌株之外,C.glutamicum也是一种很有潜力的外源蛋白表达宿主。该宿主具有较好的分泌系统,能够将表达出的外源蛋白分泌到胞外,简化下游的分离纯化过程。目前,利用C.glutamicum为表达宿主,在表达元件的开发上取得了一些进展并表达了部分外源蛋白,但相对于常用的以大肠杆菌（Escherichia coli）为宿主的外源蛋白表达系统,尚有不足之处。主要表现在,可用的表达元件较少,表达水平较低等。因此,有必要开发更多可用的表达元件以适应外源蛋白表达的需要,同时对宿主进行改造以使蛋白产量进一步提高。本论文以C.glutamicum CGMCC1.15647高效分泌表达外源蛋白为目的,筛选了高效的PcspB2启动子和cspB2信号肽等表达元件,并对宿主进行改造,包括基因组整合目的基因、敲除蛋白酶和细胞表面蛋白组分等,结合双质粒表达,构建了高效的C.glutamicum分泌表达系统。主要研究结果如下:（1）发现高效表达自身蛋白的Paph启动子,通过构建单顺反子和双顺反子表达载体,分析了不同的RBS序列对报告蛋白EGFP的影响,得到双顺反子结构结合RBS序列RM3表达的EGFP荧光强度最高。对Paph启动子的-10区进行突变之后,EGFP、α-淀粉酶和单域抗体（variable domain of the heavy-chain antibody,VHH）表达量分别提高至1.1、1.5和1.1倍。选取12个来自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis 168）中高表达蛋白的启动子,结合筛选到的RBS序列RM3构建双顺反子表达载体,以EGFP为报告蛋白,筛选到表达组件BSB4,用此组件表达单链抗体（single chain antibody fragment,ScFv）产量超过100 mg/L。（2）对C.glutamicum分泌蛋白进行质谱分析,筛选到高效的CspB2信号肽,结合C.glutamicum强内源启动子PAH6和RBS序列RM3构建双顺反子表达载体,成功分泌表达了木聚糖酶和VHH,表达出的木聚糖酶在摇瓶产量为486.2U/mL,在5 L发酵罐水平为1648.7 U/mL;分泌表达VHH产量是利用RM3V’启动子的2.4倍。当利用PcspB2启动子和cspB2信号肽分泌表达木聚糖酶时,木聚糖酶在摇瓶水平的产量为596.7 U/mL,经过培养基优化（单因素筛选、PB实验、最陡爬坡试验和中心组合实验）,木聚糖酶的分泌表达量达到1849.03 U/mL。对木糖酶的部分酶学性质进行研究,发现该酶的最适催化温度和pH值分别为45℃和pH4.5,在pH4-11范围内较为稳定和50℃之前较为稳定,Cu2+和SDS等抑制木聚糖酶活性,Co2+和Mn2+等能激活木聚糖酶活性。（3）对宿主进行改造,提高外源蛋白表达量。利用PcspB2启动子和cspB2信号肽表达木聚糖酶时,发现其在C.glutamicum CGMCC1.15647中的分泌表达量能发挥较高水平,在C.glutamicum ATCC13032中的表达水平为来源菌的28.61%。敲除宿主的S层蛋白CspB2和蛋白酶ClpS,木聚糖酶的分泌表达量分别提高了107.56和195.96 U/mL;木聚糖酶基因整合到敲除了cspB2和clpS的宿主基因组并且双质粒表达木聚糖酶得到重组菌ΔcspB2ΔclpSInX+P19-X+pEC-X,木聚糖酶在24孔板水平的分泌表达量达到2492.88 U/mL,相对于基因组整合表达和带有pXMJ19-xynA质粒的野生型菌株表达分别提高了10.43和0.35倍。重组菌ΔcspB2ΔclpSInX+P19-X+pEC-X在5 L发酵罐水平达到3537.24 U/mL（1768.62mg/L）。此外,我们在C.glutamicum中分泌表达了普鲁兰酶,密码子优化和宿主优化提高了普鲁兰酶的分泌表达量,普鲁兰酶在5 L发酵罐水平最高达108.13U/mL。
孔德荣[3]（2017）在《红鳍东方鲀IFN-γ基因的重组表达及其免疫应答的研究》文中进行了进一步梳理干扰素γ（interferon-gama,IFN-γ）是一类由特定免疫细胞分泌的多功能蛋白质。IFN-γ属于Ⅱ型干扰素,温度稳定性及耐酸性较差,易失活。但IFN-γ具有抑制肿瘤细胞生长、抗病毒、抗寄生虫感染、调节机体特异性免疫等功能,目前已将重组IFN-γ生物制剂应用于人乙型、丙型肝炎的治疗过程并取得了良好的治疗效果。因此,IFN-γ在治疗病毒性疾病、调节机体免疫力方面具有良好的应用前景。鱼类干扰素研究虽起步相对较晚,但成果较为显着,已通过基因工程等方法获得多种鱼的IFN基因及重组蛋白。本研究是利用基因工程方法构建重组工程菌获得具有生物学活性的重组蛋白。从NCBI获得红鳍东方鲀干扰素γ基因ORF序列,利用生物学软件分析其序列特征,获得成熟肽序列。根据密码子偏爱性对红鳍东方鲀IFN-γ成熟肽序列进行优化。优化后的序列与质粒pPICZαA相连,双酶切鉴定。利用限制性内切酶SacⅠ将重组质粒进行线性化,电转化整合到毕赤酵母GS115基因组中。用含有高浓度Zeocin的培养基进行高拷贝菌株的筛选,BMGY/BMMY液体培养基进行扩大培养及诱导表达,SDS-PAGE电泳检测获得分子量约为24 kDa的重组红鳍东方鲀IFN-γ蛋白粗品。细胞病变抑制法检测重组IFN-γ蛋白活性为2018 U/mL。将不同稀释度的重组蛋白液与标准品分别刺激受病毒感染的WISH细胞,测定各浓度下WISH细胞吸光度值并绘制增殖曲线,结果表明,重组红鳍东方鲀IFN-γ蛋白能够抑制病毒感染并促进WISH细胞增殖,与干扰素标准品具有一致的趋势。利用实验室已有的原核表达菌株进行红鳍东方鲀IFN-γ的重组表达,获得浓度为0.346mg/mL的重组IFN-γ蛋白,并对其效价进行检测,结果证明原核表达的重组IFN-γ蛋白活性效价为1.7×105 U/mL,比真核表达的重组IFN-γ蛋白活性高,该结果为后续免疫实验奠定基础。以不同浓度（25μg/mL rIFNg-γ为实验组1、50μg/mL r IFNg-γ为实验组2）的原核表达的重组IFN-γ蛋白免疫6月龄健康红鳍东方鲀,PBS作为对照组,于腹腔注射后6、12、24、36 h取肾脏组织。Trizol法提取组织总RNA,反转录cDNA第一链,实时定量PCR检测IFN-α、IFN-γ、MHCⅠ、Mx1基因特异性及其在肾脏组织内不同时间的表达量差异。结果显示,红鳍东方鲀免疫后6-36 h,IFN-α基因在实验组1中的表达呈现先上升后下降的趋势,24 h时表达量最高;在实验组2中的表达量在6 h最高,随后呈下降趋势。IFN-γ、MHCⅠ在免疫后6 h表达量都出现最大值且实验组1高于实验组2,随后呈下降趋势。Mx1基因的表达则出现上升趋势,24 h时表达量最高,随后下降。利用RNA-Seq分析红鳍东方鲀PBS组和IFN-γ组肾组织转录组,共测得Raw datas分别为29,939,506和24,630,588。原始数据经过滤后分别得到的Clean reads为29,415,565和23,943,395。通过差异基因筛选得到292个差异基因,其中171个在IFN-γ组肾组织中上调表达。GO、KEGG对差异基因进行分类和富集分析。对转录组进行SNP分析,两组分别得到118,876和114,091个SNP位点,其中转换型数量居多。
吴倩[4]（2016）在《腺病毒快速浓缩与纯化方法的建立和溶菌酶与γ干扰素共表达重组腺病毒的构建》文中指出腺病毒（adeno virus, Ad）载体具有感染宿主范围广、转导效率高和不易引起插入突变等优点,因此广泛应用作基因治疗和基因工程疫苗的载体,但现有的重组腺病毒制备方法具有费时、成本高、不易规模化等缺点。受体结合捕获（receptor-binding capture）技术能从组织和环境样品中浓缩病毒,将其与PCR等技术相结合可用于病毒的浓缩和环境监测。类弹性蛋白多肽（Elastin-like polypeptide, ELP）是一种人工合成的蛋白聚合物,具有温度敏感相变特性,即随着溶液温度的变化由可溶性状态变为不可溶凝聚状态,已广泛用作重组蛋白的纯化标签。将ELP的温度敏感相变特性与柯萨奇病毒-腺病毒受体（coxsachievirus and adenovirus receptor, CAR）结合腺病毒的特异性相结合,用重组大肠杆菌表达的ELP-CAR融合蛋白有望建立简单、快速、经济的腺病毒浓缩与纯化方法。奶牛乳房炎严重地制约着奶牛业的发展,目前一般采用抗生素防治。但奶牛乳房炎的病原种类复杂,中小型奶牛场一般不进行病原菌鉴定和药物敏感性检测,长期、盲目使用抗生素不仅治疗效果不佳,而且药物残留和耐药菌株日益严重。溶菌酶是一种细胞壁溶解酶,对多种革兰氏阳性菌具有直接溶菌作用,在补体等体液因子参与下对革兰氏阴性菌也有一定的溶菌作用,表达溶菌酶的重组质粒对奶牛乳房炎具有良好的防治效果。γ干扰素（IFN-γ）是一种高活性、多功能细胞因子,能提高机体的免疫和抗感染能力,重组大肠杆菌表达的牛丫干扰素对奶牛乳房炎也有一定的治疗效果。因此,溶菌酶与BoIFN-γ共表达重组腺病毒对奶牛乳房炎可能具有更好的治疗效果。一、ELP-CAR融合蛋白的表达与纯化：依次将ELP、CAR间隔区和CAR D1区编码序列插入原核表达载体pET-30a,将重组质粒pET-ELP-CAR转化BLR（DE3）大肠杆菌,在20℃利用IPTG诱导融合蛋白表达,在优化条件下利用ELP的温度敏感逆向相变循环（ITC）纯化融合蛋白。结果显示：ELP-CAR融合蛋白在重组大肠杆菌中获得可溶性表达,第一轮逆向相变循环获得的融合蛋白纯度为89.4%,再次逆向相变循化后的纯度达94.5%。Western-blot鉴定结果显示：纯化的ELP-CAR融合蛋白能被CAR抗体识别。这些实验结果表明,本研究成功纯化出了ELP-CAR融合蛋白。二、腺病毒快速浓缩与纯化方法的建立：将rAd-GFP与ELP-CAR融合蛋白混合,4℃孵育1h后用ITC沉淀,经PCR检测证明rAd-GFP能被ELP-CAR融合蛋白结合和沉淀。将不同浓度ELP-CAR融合蛋白与rAd-GFP在不同温度、pH条件下孵育不同时间,用ITC回收结合的rAd-GFP,病毒滴定结果显示120mg/ml的ELP-CAR与rAd-GFP在18℃、pH7.0孵育30min的结合效率最佳。将结合融合蛋白的rAd-GFP在不同温度、pH条件下洗脱不同时间,病毒滴定结果显示最佳洗脱条件为20℃、 pH9.0、10min。在优化条件下分别从rAd-GFP感染细胞培养上清和裂解细胞中纯化重组腺病毒,结果显示rAd-GFP的获得率分别为76.2%和73.3%。在优化条件下洗脱从rAd-GFP感染细胞培养上清和裂解细胞纯化的rAd-GFP,结果显示回收率分别30.6%和34.5%,与高压液相色谱和氯化铯密度梯度的回收率相当。分别用结合ELP-CAR融合蛋白和洗脱的rAd-GFP感染CAR阳性PK-15细胞、CAR弱阳性CHO-K1细胞和CAR阴性NIH 3T3细胞,荧光显微镜观察结果显示洗脱和未洗脱重组腺病毒均能感染PK-15和CHO-K1细胞,不能感染NIH 3T3细胞。用含或不含10%犊牛血清的细胞培养液稀释洗脱和未洗脱重组腺病毒,分别感染PK-15和CHO-K1细胞,流式细胞仪计数结果表明洗脱和未洗脱重组腺病毒均能有效转导PK-15细胞,而且受犊牛血清的影响较小；对于CHO-K1细胞,洗脱腺病毒的转导效率显着高于未洗脱重组腺病毒,而且受犊牛血清的影响较大。将不同浓度rAdv-GFP接种自来水和PBS,然后加入ELP-CAR融合蛋白,孵育一定时间后用ITC回收,荧光定量PCR检测结果表明ELP-CAR融合蛋白从PBS和自来水中捕获病毒的效率分别为74%和63%。三、双表达腺病毒载体的构建：用化学合成或PCR扩增脑心肌炎病毒（EMCV）、Gtx同源异型蛋白（Gtx）、人蛋白翻译起始因子4G （EIF4G）、人胶原诱导蛋白（hVCIP）和鼠胶原诱导蛋白（mVCIP）的内部核糖体进入位点（IRES）,测序鉴定正确后分别插入腺病毒载体pShuttle-CMV,构建获得双表达腺病毒载体pShuttle-IRES.分别以含人溶菌酶（hLYZ）和绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组质粒为模板,用PCR扩增LYZ和GFP基因,分别插入pShuttle-IRES载体IRES位点的上游和下游,获得5种重组载体pShuttle-LYZ-IRES-GFP。分别用脂质体转染法将5种重组载体转染PK15、AAV-293、 CHO-K1和MDBK细胞,用流式细胞术等检测GFP阳性细胞及荧光强度,结果表明EIF4G IRES能在四种不同细胞中有效表达下游GFP基因。四、溶菌酶与γ干扰素共表达重组腺病毒的制备及表达检测：根据BoIFN-y编码序列设计引物,两端分别引入XhoⅠ、HindⅢ酶切位点,以pGEX-IFNγ质粒为模板PCR扩增BoIFN-γ序列,PCR产物经XhoⅠ和HindⅢ酶切消化后,取代pShuttle-LYZ-EIRES-GFP中的GFP编码序列,获得共表达重组腺病毒载体pShuttle-LYZ-EIRES-IFNy,用常规构建方法转化大肠杆菌获得同源重组质粒,转染AAV-293细胞获得重组腺病毒。电镜观察结果表明：重组病毒rAd-LYZ-IRES-IFN具有典型的腺病毒形态,PCR能从其基因组DNA中扩增到预期的461 bp hLYZ基因片段和509bp BoIFN-y基因片段。用重组腺病毒感染PK-15细胞,经RT-PCR和间接免疫荧光法检测证明,重组腺病毒能正确表达hLYZ和BoIFNy蛋白。
吴昱[5]（2013）在《表达犬γ干扰素重组乳酸乳球菌的构建及体外抗病毒活性检测》文中认为γ干扰素（IFN-γ）也称为免疫干扰素，主要由活化T细胞、NK细胞产生，具有抑制病毒复制，抗肿瘤，抗寄生虫及免疫调节等作用，随着养犬业的发展，犬的种类和数量增多，疾病尤其是病毒病危害犬的健康与生存，因此作为一种重要的免疫增强剂，犬γ干扰素（CaIFN-γ）作为病毒性疾病的预防、免疫治疗及疫苗佐剂方面具有很好的应用前景。为获得抗CaIFN-γ蛋白的兔血清抗体，本实验将CaIFN-γ基因通过EcoR I、Sal I酶切位点与表达载体pET30a连接，构建了重组表达质粒pET30a-CaIFN-γ，并转入大肠杆菌，经诱导表达CaIFN-γ蛋白，SDS-PAGE和western blot结果显示，重组蛋白约23ku并主要以包涵体形式存在。重组蛋白纯化后肌注家兔，制备出CaIFN-γ的抗血清，测得血清效价为1:12800。依据乳酸球菌常用氨基酸密码子的偏嗜性，对CaIFN-γ基因进行了优化并合成。以乳酸乳球菌pH诱导分泌型质粒pAMJ399作为表达载体，构建了重组质粒pAMJ399-CaIFN-γ,并电转化至乳酸乳球菌PSM565中，构建重组乳酸乳球菌pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565，通过自身产酸启动诱导。SDS-PAGE结果表明，菌体中可见约20ku的目的蛋白；Western blot检测结果显示，在培养上清和菌体中都可见与兔抗CaIFN-γ抗体特异性发生反应的约20ku的目的蛋白，可见CaIFN-γ蛋白在重组乳酸乳球菌中获得了表达，重组蛋白既可以以分泌上清的形式存在于培养液中，同时在菌体内也存在表达的蛋白。为提高重组乳酸菌的表达量，通过对生长曲线及pH对生长曲线的影响确定发酵罐发酵的条件，结果表明32℃，搅拌速度50rpm，6h后以0.5s/min速率补充50%葡萄糖可提高重组乳酸菌的活菌数，其中pH维持在5.5和5.75时，培养上清中的表达量分别约为460ng/ml和400ng/ml要多于pH在6和6.25的表达量。为检测重组乳酸乳球菌表达CaIFN-γ的抗病毒活性，将重组菌诱导的菌液上清，过滤除菌后通过倍比稀释与MDCK细胞共孵育24h，接种水疱性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus，VSV）进行攻毒检测CaIFN-γ的抗病毒活性，30h后显微镜下观察细胞病变情况，可见与CaIFN-γ共孵育组的细胞生长状况良好，而未添加CaIFN-γ的对照组细胞发生明显病变，细胞圆缩、聚集、脱落；通过MTT法检测统计分析结果可见，5倍浓缩上清的CaIFN-γ组相比病毒组差异极显着（P<0.01），可见重组乳酸乳球菌分泌的CaIFN-γ上清具有良好的抗病毒活性；应用SYBR Green实时定量PCR方法测定干扰素作用后的MDCK细胞攻毒之后的病毒感染量，可见重组菌组pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565与空载体组pAMJ399/PSM565和病毒组的ΔCt值相比较差异均显着（P＜0.01），表明重组菌pAMJ399-CaIFN-γ/PSM565分泌上清5倍浓缩作用的MDCK细胞攻毒后的病毒载量明显低于病毒组，即重组菌表达的犬γ干扰素起到了明显的抗病毒作用。以上结果表明，本实验获得的重组乳酸乳球菌表达的犬γ干扰素为临床上的抗病毒应用和作为细胞因子佐剂的研究奠定了坚实的基础。
李公美[6]（2013）在《吉林白鹅α/γIFN原核表达、抗病毒活性及其核酸疫苗免疫佐剂作用的研究》文中研究表明由于干扰素具有良好的广谱抗病毒活性和有效的免疫调节功能,对于研发有效的抗病毒生物制剂及增强疫苗效果的佐剂具有重要的意义。本研究利用基因工程技术,以吉林白鹅α/γ干扰素基因（JGIFN-α/γ）为研究对象,对其进行了克隆、表达及抗病毒活性研究。同时为了进一步研究JGIFN-γ作为佐剂的免疫增强作用,成功构建了带有分子免疫佐剂JGIFN-γ的GPV-VP3基因疫苗并对雏鹅进行了免疫,为研发高效的鹅细小病毒基因疫苗奠定了基础,本研究具体进行了以下几方面的工作：1、吉林白鹅α干扰素成熟肽原核表达及抗病毒活性的研究参照已克隆得到的JGIFN-α完整的ORF基因序列设计了一对特异性引物,克隆得到了编码α干扰素的成熟肽基因（mJGIFN-a）。利用pET28a （+）作为原核表达载体,成功构建了吉林白鹅α干扰素基因的原核表达质粒pET-mJGIFN-a。将该重组表达质粒转化入E.coli Rossetta菌中进行了表达,经IPTG诱导、SDS-PAGE和western-blot分析表明获得了分子量为22ku的包涵体蛋白。将包涵体蛋白经Ni-IMAC亲和层析法纯化及稀释透析复性后,得到了与预期结果一致nJGIFN-a重组蛋白。采用微量细胞病变抑制法分析mJGIFN-a重组蛋白的抗病毒活性,表明其抗病毒活性为7.9×102U/mL,比活性为1.3×103U/mg。同时通过FQ-PCR方法研究动态检测抗鹅细小病毒（GPV）的生物活性,结果发现该重组蛋白能够抑制GPV的复制,具有明显的抗病毒活性,为制备应用于临床上的抗病毒生物制剂研究提供了科学依据。2、吉林白鹅γ干扰素基因序列分析、原核表达及抗病毒活性采用RT-PCR的方法从吉林白鹅外周血单核细胞中扩增得到了Y干扰素基因（JGIFN-γ）,构建了重组克隆质粒pMD-JGIFN-γ。利用生物信息学软件及在线分析软件对JGIFN-γ基因的核酸及氨基酸序列进行了分析。分析13个不同动物的相关基因结果表明JGIFN-γ与同为水禽的鸭、鹅的核苷酸和氨基酸同源性均高于90%,在进化树上位于同一分支。JGIFN-γ蛋白含有4个潜在的疏水区、3个N-糖基化位点、10个磷酸化位点。对其亚细胞定位预测结果为大部分蛋白分布于在细胞核内,其余分别在线粒体、细胞质、质膜上、内质网上、高尔基氏体及细胞外,为进一步研究γ干扰素蛋白的功能特性提供了理论依据。二级结构预测结果显示该肽链主要由α-螺旋组成,包括4个抗原指数较高的抗原表位,表明γ干扰素具有良好的抗原性,为进一步研究其作为分子佐剂提供了理论依据。同时成功的构建了原核表达质粒pET-JGIFN-γ,获得了JGIFN-γ重组蛋白,将该重组蛋白经Ni-IMAC亲和纯化及稀释透析复性后,采用微量细胞病变抑制发分析其抗病毒活性,结果表明其抗病毒活性为1.9×102U/mL,比活性为4.3×102U/mg,为研究γ干扰素蛋白的生物学活性提供了科学依据。3、吉林白鹅IFN-γ及其与VP3融合基因核酸疫苗的制备与表达研究通过重叠延伸PCR （SOE-PCR）技术得到包含了缺失TAA终止密码子的JGIFN-γ基因和缺失了ATG起始密码子的VP3的融合基因JGIFN-γ-VP3,两个基因之间由高亲水性氨基酸Gly-Gly-Gly-Ser编码的核苷酸连接起来。分别将JGIFN-γ和JGIFN-γ-VP3融合基因通过基因重组技术正向插入到pVAX1CMV启动子下游BamHI和HindⅢ酶切位点之间,成功构建了真核重组表达质粒pVAX-JGIFN-γ和pVAX-JGIFN-γ-VP3。利用脂质体介导法将其转入Vero细胞中,通过间接免疫荧光技术和RT-PCR技术证实JGIFN-γ基因和JGIFN-γ-VP3融合基因在Vero细胞中获得了表达,为进一步研究γ干扰素基因作为基因疫苗的分子佐剂奠定了基础。4、GIFNγ-VP3真核表达质粒对雏鹅的免疫研究为研究真核重组表达质粒pVAX-JGIFN-γ+pVAX-VP3/pVAX-JGIFNγ-VP3免疫调节特性,将不同剂量pVAX-JGIFN-γ-VP3质粒和不同剂量pVAX-JGIFN-γ质粒与pVAX-VP3质粒联合使用免疫28日龄鹅。同时设pVAX-VP3质粒免疫组、小鹅瘟弱毒疫苗、pVAX1、生理盐水对照组。对不同时间点鹅外周血淋巴细胞增殖试验的结果表明,pVAX-JGIFN-γ-VP3基因免疫组细胞免疫水平高于pVAX-JGIFN-γ+pVAX-VP3基因疫苗免疫组,同类疫苗中且呈现剂量相关性。分子佐剂基因疫苗免疫组显着高于pVAX-VP3基因疫苗免疫组但显着低于GPV弱毒疫苗组（P<0.05）。间接ELISA方法检测鹅体内IgG动态变化规律结果表明,pVAX-JGIFN-γ-VP3和pVAX-JGIFN-γ+pVAX-VP3所诱导的体液免疫的抗体水平,明显高于pVAX-VP3单基因疫苗免疫组（P<0.05）,但显着低于GPV弱毒疫苗组（P≤0.05）。同时采用微量血清中和抗体试验检测了各组疫苗免疫后所诱导的中和抗体水平结果表明,各基因疫苗和GPV弱毒株均能较长时间诱导雏鹅产生针对GPV的中和抗体,含分子佐剂GPV-VP3基因疫苗的中和抗体水平比不含佐剂的GPV-VP3基因疫苗组高；而注射pVAX1和生理盐水的对照组均不能保护GPV对鹅成纤维细胞的感染,说明了DNA基因疫苗和GPV弱毒疫苗免疫所诱导的中和抗体均在一定程度上可以保护GEF不被GPV感染。
李春松[7]（2011）在《减毒沙门氏菌介导TGEV S基因与pIL-6基因双顺反子DNA疫苗的构建与免疫原性研究》文中指出猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis of pigs, TGE）是由冠状病毒科冠状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus, TGEV）引起的一种猪的呕吐、腹泻和严重脱水为特征的急性、高度接触性传染性肠道疾病,TGEV的疫苗研究是预防该病重要的研究方向,本研究主要进行了减毒沙门氏菌介导TGEV S基因与猪白细胞介素6（pIL-6）基因双顺反子DNA疫苗的构建与免疫原性研究。1. TGEV S基因和pIL-6基因的双顺反子真核表达质粒的构建与鉴定首先,设计TGEV S基因引物和不同酶切位点,以pMD19T-S质粒为TGEV S基因扩增模板,重新构建TGEV S基因的T克隆载体,并将S基因插入双启动子载体真核表达载体pVAXD上的第二个多克隆位点,成功构建了真核表达载体pVAXD-S,对其进行双酶切和PCR鉴定,表明真核载体的TGEV S基因大小为2000bp左右。其次,设计pIL-6引物和不同酶切位点,以pMD19T-IL6为扩增pIL-6基因模板,重新构建了pIL-6基因T克隆载体,然后将pIL-6基因插入构建好的真核表达载体pVAXD-S中并进行鉴定,表明构建的真核表达载体中pIL-6基因大小为500bp左右,成功构建了真核表达载体pVAXD-S-IL6。分别将构建好的2种真核表达载体pVAXD-S-IL6和pVAXD-S通过脂质体转染法转入COS-7细胞中进行真核表达,并分别以RT-PCR和免疫荧光抗体两种种检测方法进行检测。RT-PCR检测真核表达载体pVAXD-S-IL6时,扩增到TGEV S基因2000bp左右和pIL-6基因500bp左右的两条条带,同时对pVAXD-S检测,则可扩增到一条TGEV S基因2000bp左右条带；免疫荧光抗体检测试验结果为pVAXD-S-IL6和pVAXD-S转染孔细胞都能检测到特异性免疫荧光。两种检测结果均证明pVAXD-S-IL6和pVAXD-S在COS-7细胞中得到了良好的表达,为重组沙门氏菌DNA疫苗的进一步研究奠定了基础。2.减毒沙门氏菌携带TGEV S基因和pIL-6基因DNA疫苗口服免疫的研究重组沙门氏菌构建及鉴定：将构建好的真核表达载体pVAXD-S-IL6和pVAXD-S分别通过电转入法转入减毒沙门氏菌SL7207中,构建重组沙门氏菌SL7207（pVAXD-S-IL6）和SL7207（pVAXD-S）,通过对重组菌进行PCR和双酶切鉴定,SL7207（pVAXD-S-IL6）出现2000bp和500bp左右的条带,SL7207（pVAXD-S）检测出2000bp左右条带,证明成功构建了重组沙门氏菌；对该重组沙门氏菌SL7207（pVAXD-S-IL6）进行稳定性试验,证明该菌在含抗生素培养环境下重组菌中的质粒比较稳定;将小鼠随机分成四组,8只/组,分别灌胃接种免疫SL7207（pVAXD-S-IL6）、SL7207（pVAXD-S）、SL7207（pVAXD）和对照组PBS,灌胃后1-2天,部分小鼠出现精神不振,扎堆食欲降低等现象,灌胃一段时间后小鼠恢复,活动正常,说明该菌该浓度对小鼠是安全的。小鼠分组、免疫及采样：将小鼠随机分成四组,16只/组,小鼠共免疫3次,每次间隔两周,分别灌胃接种SL7207（pVAXD-S-IL6）、SL7207（pVAXD-S）、SL7207（pVAXD）三组接种剂量均为1×109CFU,和对照PBS组接种PBS 0.2ml,在免疫前和免疫后2、4、6周,每组分别摘眼采集3只小鼠血清和完整的小肠,在第四次采样前每组随机选取两只小鼠采集脾淋巴细胞进行Y-干扰素检测。检测抗体的抗原制备：以保存菌pET32a-Sbc BL21（DE3）进行复苏鉴定,表达TGEV S蛋白上38KD左右的B、C抗原决定簇位点,将表达的蛋白进行纯化,对表达的蛋白和纯化后的蛋白进行SDS-PAGE,在38KD左右出现特异性条带,证明TGEVS蛋白正确的得到了表达和纯化。最后以表达纯化的蛋白作为包被抗原检测待检血清和肠道样品,样品检测结果：用以检测小鼠特异性TGEV和沙门氏菌IgG、IgA抗体水平,通过检测发现SL7207（pVAXD-S）,SL7207（pVAXD-S-IL6）成功激发了TGEV和沙门氏菌抗体（P<0.01）。在第4周SL7207（pVAXD-S-IL6） IgA和IgG抗体水平分别为0.195和0.363,SL7207（pVAXD-S）组IgA和IgG抗体水平分别为0.210和0.402,SL7207（pVAXD-S-IL6）组中抗体均低于SL7207（pVAXD-S）组但无明显差异（P>0.05）,但两者抗体水平均显着差异与对照组（P<0.01）；在第6周SL7207（pVAXD-S-IL6） IgA和IgG抗体水平分别为0.253和0.466,SL7207（pVAXD-S） IgA和IgG抗体水平分别为0.210和0.421 SL7207（pVAXD-S-IL6）组两中抗体均高于SL7207（pVAXD-S）组,其中前者IgA抗体极显着差异于后者（P<0.01）,IgG抗体则显着差异于后者（P<0.05）,与对照组比较均有显着差异（P<0.01）。同时,第6周采集样品前,脾淋巴细胞检测γ-干扰素水平,检测结果显示SL7207（pVAXD-S）, SL7207（pVAXD-S-IL6）γ-干扰素浓度（约为1100pg/ml左右）高于SL7207（pVAXD）和PBS免疫组浓度（约为700 pg/ml左右）。
代丽,单安山,孙进华[8]（2009）在《γ-干扰素的研究进展及在畜牧中的应用》文中认为γ-干扰素（interferon gamma,IFN-γ）也叫免疫干扰素,在抗病毒、抗肿瘤和免疫调节上作用强大。针对IFN-γ及其受体、IFN-γ的基因表达调控、生物学功能及在畜牧生产中的应用作一概述。
周磊[9]（2008）在《牛γ-干扰素和人溶菌酶共表达载体的构建和表达产物的纯化》文中进行了进一步梳理一、牛γ-干扰素和人溶菌酶共表达载体的构建及表达分别将牛γ干扰素基因（BoIFN-γ）和内部核糖体位点（IRES）从pFAST-IFN载体和pIRES载体质粒上双酶切回收,亚克隆到pFASTBac-hLyz载体中,构建转移载体pFASTBAC1-IFN-IRES-hLyz;转移载体质粒转化DH10Bac感受态大肠杆菌,通过位点特异性转座作用将牛γ干扰素基因（BoIFN-γ）和人溶菌酶基因（hLyz）整合到Bacmid穿梭载体中。在含庆大霉素、四环素、卡那霉素、IPTG和X-gal的LB平板上筛选发生转座的白色菌落,提取DNA,获得重组穿梭载体Bacmid-IFN-IRS-hLyz;将重组穿梭载体Bacmid-IFN-IRS-hLyz用脂质体介导转染Sf9昆虫细胞,产生有感染力的重组杆状病毒; PCR扩增结果证实BoIFN-γ和hLyz基因重组到杆状病毒基因组中;表达产物中含有牛γ-干扰素和人溶菌酶重组蛋白。二、牛γ-干扰素真核表达产物的纯化分别以不同MOI的重组病毒感染Sf9细胞,并在感染后不同时间段收集上清,进行表达产物的活性检测,选择最佳的优化条件进行重组蛋白的大量生产。将重组牛γ干扰素感状病毒感染Sf9细胞,5天后收获细胞上清,透析浓缩后,用羟基磷灰石层析和疏水层析过柱,获得初步纯化的牛γ干扰素重组蛋白。
姚清侠,黄勤锋,曹毅,司有辉,钱平,陈焕春[10]（2008）在《猪γ-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒作用》文中研究说明为了获得高效分泌表达重组猪γ-干扰素（rPoIFNγ） ,将去除信号肽的编码梅山猪γ-干扰素成熟蛋白基因（mPoIFNγ）插入酵母-大肠杆菌穿梭载体pPIC 9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC 9K-mPoIFNγ。将线性化的pPIC9K-mPoIFNγ以化学方法（LiCl）转化入毕赤酵母菌株GS115（组氨酸缺陷型） ,转化子经MD平板筛选和PCR分析鉴定后,以G418（4 g/L）筛选到多拷贝菌株。SDS-PAGE和Western-blot检测结果表明,所获得的重组子能够分泌表达出17 000和23 000左右的mPoIFNγ特异蛋白,其表达量约为120 mg/L,占分泌型总蛋白的65 %;细胞病变抑制法（CPE50）测定干扰素生物活性,结果表明rPolIFNγ具有较高的抗病毒生物活性,在MDBK中的抗VSV比活性为1.67×106U/mg。
二、猪γ-干扰素双顺反子表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪γ-干扰素双顺反子表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达（论文提纲范文）
（1）谷氨酸棒杆菌增强型表达载体构建及牛α-干扰素表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株、质粒和引物 |
| 1.1.2 酶和试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 培养基和摇瓶培养条件 |
| 1.2.2 质粒的构建 |
| 1.2.3 增强型绿色荧光蛋白强度的测定 |
| 1.2.4 RNA提取及转录起始位点的鉴定 |
| 1.2.5 BoIFN-α干扰素的表达、纯化 |
| 1.2.6 BoIFN-α干扰素活性的初步测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 NCgl2826 转录起始位点的鉴定 |
| 2.2 增强型表达载体pSM19的构建 |
| 2.3 EGFP表达对比 |
| 2.4 牛α-干扰素的表达 |
| 2.5 牛α-干扰素的纯化与活性测定 |
| 3 讨论与结论 |
（2）谷氨酸棒杆菌外源蛋白分泌表达系统的开发及其应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 原核蛋白表达系统概述 |
| 1.1.1 E.coli表达系统 |
| 1.1.2 B.subtilis表达系统 |
| 1.1.3 Corynebacterium glutamicum表达系统 |
| 1.2 C.glutamicum表达系统特点 |
| 1.2.1 C.glutamicum的简介 |
| 1.2.2 C.glutamicum中蛋白分泌系统 |
| 1.2.3 C.glutamicum表达外源蛋白概况 |
| 1.3 C.glutamicum表达系统的组成 |
| 1.3.1 表达系统元件 |
| 1.3.2 表达载体 |
| 1.3.3 启动子和SD序列 |
| 1.3.4 信号肽 |
| 1.3.5 其他表达元件结构 |
| 1.4 C.glutamicum表达系统优化策略 |
| 1.4.1 表达载体的优化策略 |
| 1.4.2 宿主优化策略 |
| 1.4.3 其他提高表达量的方法 |
| 1.5 本研究中涉及外源蛋白的介绍 |
| 1.5.1 α-淀粉酶的介绍 |
| 1.5.2 VHH的介绍 |
| 1.5.3 木聚糖酶的介绍 |
| 1.5.4 普鲁兰酶的介绍 |
| 1.6 本课题的立题依据与研究内容 |
| 1.6.1 立项依据与研究意义 |
| 1.6.2 主要研究内容 |
| 第二章 外源表达组件的筛选及其在C.glutamicum中的应用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株、质粒 |
| 2.2.2 主要试剂和溶液 |
| 2.2.3 培养基和培养条件 |
| 2.2.4 遗传操作方法 |
| 2.2.5 载体构建 |
| 2.2.6 QRT-PCR测定egfp的转录水平 |
| 2.2.7 egfp荧光强度的测定 |
| 2.2.8 蛋白的纯化和酶活的测定 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 pDXW-8 载体在C.glutamicum CGMCC1.15647 表达egfp水平的检测 |
| 2.3.2 Paph启动子的发现和验证 |
| 2.3.3 Paph启动子的活性分析 |
| 2.3.4 Paph启动子的优化 |
| 2.3.5 Paph启动子的应用(α-淀粉酶和VHH的表达) |
| 2.3.6 来源于B.subtilis蛋白组的启动子筛选及其应用 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 C.glutamicum CGMCC1.15647 内源元件用于蛋白的分泌表达 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 主要试剂、培养基和仪器 |
| 3.2.3 C.glutamicum内源信号肽的筛选和鉴定 |
| 3.2.4 内源信号肽的应用 |
| 3.2.5 木聚糖酶在5 L发酵罐中的分泌表达 |
| 3.2.6 木聚糖酶活性的检测 |
| 3.2.7 营养要素对产木聚糖酶的影响 |
| 3.2.8 培养基的优化 |
| 3.2.9 木聚糖酶的纯化、SDS-PAGE和 Western blot |
| 3.2.10 木聚糖酶酶学性质的研究 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 C.glutamicum信号肽的识别与鉴定 |
| 3.3.2 CspB2 信号肽应用于外源蛋白的分泌 |
| 3.3.3 木聚糖酶在5 L发酵罐的分泌表达 |
| 3.3.4 利用内源PcspB2启动子和cspB2 信号肽进行木聚糖酶的分泌表达 |
| 3.3.5 培养基优化 |
| 3.3.6 木聚糖酶的部分酶学性质的研究 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 基于表达元件与宿主的适配性在C.glutamicum中分泌表达外源蛋白 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株、质粒 |
| 4.2.2 主要试剂和仪器 |
| 4.2.3 培养基 |
| 4.2.4 载体及重组菌株的构建所需引物 |
| 4.2.5 表达木聚糖酶重组菌的构建 |
| 4.2.6 普鲁兰酶表达载体的构建 |
| 4.2.7 5L发酵罐扩大培养重组菌产外源蛋白 |
| 4.2.8 酶活性的测定 |
| 4.2.9 还原糖的测定 |
| 4.2.10 SDS-PAGE |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 木聚糖酶的分泌表达 |
| 4.3.2 普鲁兰酶的分泌表达 |
| 4.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（3）红鳍东方鲀IFN-γ基因的重组表达及其免疫应答的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 干扰素简介 |
| 1.1.1 干扰素的分类 |
| 1.1.2 干扰素的来源及功能 |
| 1.1.3 干扰素研究现状 |
| 1.2 干扰素 γ |
| 1.2.1 干扰素 γ 结构 |
| 1.2.2 IFN-γ 受体 |
| 1.2.3 IFN-γ 功能 |
| 1.2.4 IFN-γ 作用机制 |
| 1.2.5 IFN-γ 研究进展 |
| 1.2.6 红鳍东方鲀IFN-γ 研究现状 |
| 1.3 几种鱼类免疫因子研究概述 |
| 1.3.1 Mx蛋白 |
| 1.3.2 TNF |
| 1.3.3 趋化因子 |
| 1.3.4 MHC |
| 1.4 毕赤酵母表达系统研究进展 |
| 1.4.1 基因工程表达系统 |
| 1.4.2 毕赤酵母表达系统研究概述 |
| 1.4.3 鱼类基因在毕赤酵母中的表达 |
| 1.5 鱼类转录组分析 |
| 1.5.1 转录组和RNA-seq |
| 1.5.2 RNA-seq在鱼类中的研究进展 |
| 1.6 本研究目的与意义 |
| 第二章 红鳍东方鲀IFN-γ 真核表达及活性检测 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与细胞 |
| 2.1.2 试剂及配方 |
| 2.1.3 仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 真核表达载体的构建 |
| 2.2.2 毕赤酵母感受态细胞制备 |
| 2.2.3 电转化 |
| 2.2.4 高拷贝菌株的筛选 |
| 2.2.5 毕赤酵母高拷贝菌株的鉴定 |
| 2.2.6 蛋白诱导表达 |
| 2.2.7 重组蛋白活性验证 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 重组表达载体的构建 |
| 2.3.2 真核表达载体双酶切及线性化鉴定 |
| 2.3.3 毕赤酵母工程菌的鉴定 |
| 2.3.4 重组蛋白的表达 |
| 2.3.5 细胞培养与活性验证 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 红鳍东方鲀IFN-γ 相关免疫基因的实时定量分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 试剂盒、菌株、工具酶 |
| 3.1.3 仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 原核重组红鳍东方鲀IFN-γ 蛋白的制备 |
| 3.2.2 体内免疫试验及组织取样 |
| 3.2.3 干扰素相关免疫基因引物设计 |
| 3.2.4 组织RNA提取 |
| 3.2.5 反转录 |
| 3.2.6 实时定量PCR |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 重组蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 3.3.2 原核重组蛋白活性鉴定 |
| 3.3.3 组织总RNA提取及反转录 |
| 3.3.4 实时定量PCR引物检验 |
| 3.3.5 免疫基因的组织表达 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 红鳍东方鲀肾组织RNA-seq分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 组织RNA提取及检测 |
| 4.2.2 文库构建及上机测序 |
| 4.2.3 转录组生物信息学分析 |
| 4.3 结果及分析 |
| 4.3.1 转录组测序数据质量分析 |
| 4.3.2 测序数据比对到参考基因组(Mapping) |
| 4.3.3 基因表达量分析 |
| 4.3.4 差异基因的表达分析 |
| 4.3.5 SNP及可变剪接分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 RNA-Seq数据分析 |
| 4.4.2 鱼类对重组IFN蛋白的免疫应答 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（4）腺病毒快速浓缩与纯化方法的建立和溶菌酶与γ干扰素共表达重组腺病毒的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文简写 |
| 综述一：腺病毒载体的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二：内部核糖体进入位点的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述三：类弹性蛋白研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述四：奶牛乳房炎的研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究内容一：用于重组腺病毒纯化的ELP-CAR融合蛋白的表达与纯化 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究内容二：基于ELP-CAR融合蛋白重组腺病毒纯化方法的建立 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究内容三：核糖体内部进入序列的选择 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 共表达载体的构建 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 研究内容四：表达溶菌酶和γ干扰素重组腺病毒的制备及其表达 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录：主要溶液试剂及配制方法 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的科研成果 |
（5）表达犬γ干扰素重组乳酸乳球菌的构建及体外抗病毒活性检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 干扰素的研究概述 |
| 1.1.1 γ干扰素的发现 |
| 1.1.2 干扰素的理化性质 |
| 1.2 γ干扰素受体及其介导的信号传导机制 |
| 1.2.1 γ干扰素受体 |
| 1.2.2 γ干扰素的信号传导机制 |
| 1.2.3 不依赖 STAT 的γ干扰素信号传导途径 |
| 1.2.4 干扰素信号传导的抑制调节 |
| 1.3 干扰素的生物学特性及作用机理： |
| 1.3.1 干扰素抗病毒活性及其机理 |
| 1.3.2 干扰素的免疫调节活性 |
| 1.3.3 干扰素的抗肿瘤活性 |
| 1.4 γ干扰素的应用及发展前景 |
| 1.5 乳酸乳球菌作为宿主菌表达外源抗原的研究进展 |
| 1.5.1 乳酸乳球菌的益生作用 |
| 1.5.2 乳酸乳球菌作为活载体疫苗传递载体的优越性 |
| 1.5.3 乳酸乳球菌作为表达载体的应用 |
| 1.6 研究的目的和意义 |
| 2 材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和载体 |
| 2.1.2 病毒和细胞 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 引物设计与基因合成 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 表达 CaIFN-γ重组大肠杆菌的构建 |
| 2.2.2 CaIFN-γ在重组大肠杆菌中的诱导表达 |
| 2.2.3 多克隆抗血清的制备 |
| 2.2.4 表达犬γ干扰素重组乳酸乳球菌的构建 |
| 2.2.5 CaIFN-γ重组乳酸乳球菌的诱导表达及鉴定 |
| 2.2.6 重组乳酸乳球菌发酵罐条件优化 |
| 2.2.7 犬γ干扰素抗病毒活性检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组表达质粒 pET30a-caIFN-γ的鉴定结果 |
| 3.2 重组大肠杆菌蛋白的诱导及表达鉴定 |
| 3.2.1 重组大肠杆菌不同时间蛋白表达 |
| 3.2.2 重组蛋白 CaIFN-γ的表达形式分析 |
| 3.2.3 重组大肠杆菌表达产物 westen blot 的鉴定结果 |
| 3.3 疫兔血清抗体效价间接 ELISA 结果 |
| 3.4 重组乳酸乳球菌表达系统的构建 |
| 3.4.1 重组大肠杆菌阳性重组质粒的鉴定 |
| 3.4.2 重组乳酸乳球菌 PAMJ399-CaIFN-γ/ PSM565 的鉴定 |
| 3.5 重组乳酸乳球菌表达 CaIFN-γ蛋白的鉴定 |
| 3.5.1 重组乳酸乳球菌 SDS-PAGE 结果 |
| 3.5.2 重组乳酸乳球菌 Western-blot 结果 |
| 3.6 发酵罐条件的优化 |
| 3.6.1 不同重组菌随诱导时间变化的生长情况 |
| 3.6.2 β甘油磷酸二钠对重组菌生长情况的影响 |
| 3.6.3 发酵罐条件的优化 |
| 3.7 犬γ干扰素抗病毒活性的检测 |
| 3.7.1 干扰素细胞毒性实验 |
| 3.7.2 干扰素抗病毒活性 |
| 3.7.3 MTT 法检测干扰素抗病毒活性结果 |
| 3.7.4 MDCK 细胞攻毒后病毒载量的检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 构建重组乳酸乳球菌表达系统的立足点 |
| 4.2 重组乳酸乳球菌表达蛋白效果分析 |
| 4.3 重组犬γ干扰素抗病毒活性及检测方法分析 |
| 4.4 重组乳酸乳球菌发酵与发酵技术分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（6）吉林白鹅α/γIFN原核表达、抗病毒活性及其核酸疫苗免疫佐剂作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 干扰素的研究进展 |
| 1.1 干扰素分类及结构 |
| 1.2 干扰素作用机制 |
| 1.3 干扰素的生物学活性 |
| 1.4 禽类IFN的研究进展 |
| 第二章 鹅细小病毒研究进展 |
| 2.1 鹅细小病毒分子生物学研究进展 |
| 2.2 小鹅瘟免疫防治的研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 吉林白鹅α干扰素成熟肽基因的克隆表达及抗病毒活性的研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 吉林白鹅γ干扰素基因序列分析、原核表达及抗病毒活性测定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 吉林白鹅IFN-γ及其与VP3融合基因的真核表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 JGIFN-VP3真核表达质粒对雏鹅的免疫研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略语 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（7）减毒沙门氏菌介导TGEV S基因与pIL-6基因双顺反子DNA疫苗的构建与免疫原性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩写说明 |
| 目录 |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 猪传染性胃肠炎病毒特征和基因结构与功能 |
| 1.1 TGEV形态学特征 |
| 1.2 病理变化发病机理 |
| 1.3 TGEV的分子生物学特征 |
| 1.3.1 TGEV的基因组成 |
| 1.3.2 TGEV的四种结构蛋白 |
| 2. 减毒沙门氏菌的研究进展 |
| 2.1 减毒沙门氏菌的入侵机制 |
| 2.2 减毒沙门氏菌递呈疫苗的优缺点 |
| 3. 白细胞介素6对免疫的促进作用 |
| 4. 双顺反子系统 |
| 5. 研究目的和意义 |
| 第二章 TGEV S基因和pIL-6基因的双顺反子真核表达质粒的构建 |
| 1. 材料 |
| 1.1 菌株、质粒和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2. 方法 |
| 2.1 TGEV S基因T-A克隆载体的构建 |
| 2.1.1 TGEV S基因特异性引物设计 |
| 2.1.2 TGEV S基因质粒(pMD19T-S)菌的复苏及其提取 |
| 2.1.3 TGEV S基因的PCR扩增 |
| 2.1.4 TGEV S基因扩增产物的电泳鉴定 |
| 2.1.5 TGEV S基因目的片段凝胶回收与纯化 |
| 2.1.6 大肠杆菌(DH5α)感受态细胞的制备 |
| 2.1.7 TGEV S基因与T载体的连接 |
| 2.1.8 连接产物转化DH5 α感受态 |
| 2.1.9 TGEV S基因T-A克隆载体鉴定 |
| 2.2 TGEV S基因真核表达质粒pVAXD-S构建 |
| 2.2.1 TGEV S基因T-A与真核表达载体pVAXD-S的酶切 |
| 2.2.2 TGEV S基因与真核表达质粒pVAXD的连接 |
| 2.2.3 TGEV S基因真核表达质粒pVAXD-S的鉴定 |
| 2.3 pIL-6基因T-A克隆载体的构建 |
| 2.3.1 pIL-6基因特异性引物设计 |
| 2.3.2 pIL-6基因保存菌(pMD19T-IL)复苏及提取 |
| 2.3.3 pIL-6基因的PCR扩增 |
| 2.3.4 pIL-6目的片段的凝胶回收与纯化 |
| 2.3.5 pIL-6基因与T载体的连接 |
| 2.3.6 连接产物转化DH5 α感受态细胞 |
| 2.3.7 pIL-6基因T-A克隆载体的鉴定 |
| 2.4 TGEV S基因真核表达质粒pVAXD-S-IL6的构建 |
| 2.4.1 真核表达载体pVAXD-S与pIL-6基因T-A克隆载体的酶切 |
| 2.4.2 pIL-6基因与真核表达质粒pVAXD-S连接 |
| 2.4.3 真核表达质粒pVAXD-S-IL6的鉴定 |
| 2.5 TGEV S基因与pIL-6基因体外表达 |
| 2.5.1 转染用质粒的提取 |
| 2.5.2 细胞转染 |
| 2.5.3 转染细胞RT-PCR检测 |
| 2.5.4 间接免疫荧光检测 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 TGEV S基因T-A克隆载体的构建 |
| 3.1.1 TGEV S基因的PCR扩增 |
| 3.1.2 TGEV S基因T-A克隆载体鉴定 |
| 3.2 TGEV S基因真核表达质粒pVAXD-S的鉴定 |
| 3.3 pIL-6基因T-A克隆载体的构建 |
| 3.3.1 pIL-6基因的PCR扩增 |
| 3.3.2 pIL-6基因T-A克隆载体的鉴定 |
| 3.4 真核表达质粒pVAXD-S-IL6的鉴定 |
| 3.5 TGEV S基因与pIL-6基因体外表达 |
| 3.5.1 TGEV S基因与pIL-6基因体外表达RT-PCR检测 |
| 3.5.2 TGEV S基因真核表达质粒pVAXD-S-IL6的构建 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第三章 减毒沙门氏菌携带TGEV S基因和pIL-6基因DNA疫苗口服免疫研究 |
| 1. 材料 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试验动物 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2. 方法 |
| 2.1 TGEV Sbc蛋白的表达与纯化 |
| 2.1.1 重组菌pET32a-Sbc BL21(DE3)复苏与鉴定 |
| 2.1.2 菌株TGEV Sbc的表达与SDS-PAGE |
| 2.1.3 表达产物TGEV Sbc蛋白的纯化 |
| 2.2 减毒沙门氏菌SL7207感受态细胞的制备 |
| 2.3 真核表达质粒电转化进入减毒沙门氏菌SL7207 |
| 2.4 重组减毒沙门氏菌的鉴定 |
| 2.5 重组减毒沙门氏菌的稳定性试验 |
| 2.6 重组沙门氏菌对小鼠的免疫安全性试验 |
| 2.7 重组沙门氏菌免疫原性试验 |
| 2.8 免疫小鼠γ-干扰素的检测 |
| 2.8.1 免疫小鼠脾细胞的制备及蛋白刺激 |
| 2.8.2 免疫小鼠γ-干扰素的检测 |
| 2.9 TGEV特异性血清IgG检测 |
| 2.10 特异性肠道IgA检测 |
| 2.11 减毒沙门氏菌特异性血清IgG检测 |
| 2.12 特异性肠道IgA检测 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 TGEV S_(bc)蛋白的表达与纯化 |
| 3.1.1 重组质粒pET32a-Sbc PCR与双酶切鉴定 |
| 3.1.2 TGEV Sbc重组蛋白表达与纯化SDS-PAGE |
| 3.2 重组沙门氏菌的构建 |
| 3.3 重组减毒沙门氏菌的稳定性试验 |
| 3.4 重组沙门氏菌对小鼠的免疫安全性试验 |
| 3.5 免疫小鼠γ-干扰素的检测 |
| 3.6 TGEV特异性血清IgG检测 |
| 3.7 TGEV特异性血清肠道IgA检测 |
| 3.8 减毒沙门氏菌特异性血清IgG检测 |
| 3.9 减毒沙门氏菌特异性肠道IgA检测 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 附录(一) 质粒图谱 |
| 附录(二) 基因测序图 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）γ-干扰素的研究进展及在畜牧中的应用（论文提纲范文）
| 1 IFN-γ、IFN-γ受体概述 |
| 1.1 IFN-γ的分子结构 |
| 1.2 IFN-γ的来源 |
| 1.3 IFN-γ受体 |
| 2 IFN-γ的基因表达与调控 |
| 3 IFN-γ在畜牧方面的生物学功能及其作用机制 |
| 3.1 生物学功能 |
| 3.1.1 抗病毒作用 |
| 3.1.2 免疫调节作用 |
| 3.1.3 抗肿瘤作用 |
| 3.2 作用机制 |
| 4 在畜牧生产中的应用 |
（9）牛γ-干扰素和人溶菌酶共表达载体的构建和表达产物的纯化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 研究内容 |
| ㈠ 牛γ-干扰素和人溶菌酶共表达载体的构建及表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| ㈡ 牛γ-干扰素真核表达产物的纯化 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 成果小结 |
| 致谢 |
（10）猪γ-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒作用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒和菌株 |
| 1.2 细胞和病毒 |
| 1.3 生化试剂 |
| 1.4 猪γ-干扰素成熟蛋白基因的亚克隆 |
| 1.5 酵母穿梭重组质粒pPIC 9K-mPoIFNγ的构建和测序 |
| 1.6 酵母细胞的转化与阳性重组子的筛选 |
| 1.7 多拷贝插入重组子的筛选 |
| 1.8 酵母阳性重组子的诱导表达 |
| 1.9 抗猪γ-干扰素血清的制备 |
| 1.10 猪γ-干扰素抗VSV活性的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪γ-干扰素成熟蛋白基因的克隆 |
| 2.2 重组穿梭质粒pPIC 9K-γIFN的构建与鉴定 |
| 2.3 重组酵母菌株的筛选 |
| 2.4 SDS-PAGE及Western-blot分析 挑取GS115 |
| 2.5 mPoIFN-γ抗VSV病毒活性的检测 |
| 3 讨论 |
四、猪γ-干扰素双顺反子表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达（论文参考文献）
- [1]谷氨酸棒杆菌增强型表达载体构建及牛α-干扰素表达[J]. 孙曼曼,高雄,方求武,严豪,刘秀霞,杨艳坤,白仲虎. 生物学杂志, 2020(03)
- [2]谷氨酸棒杆菌外源蛋白分泌表达系统的开发及其应用研究[D]. 张伟. 江南大学, 2019(05)
- [3]红鳍东方鲀IFN-γ基因的重组表达及其免疫应答的研究[D]. 孔德荣. 大连海洋大学, 2017(04)
- [4]腺病毒快速浓缩与纯化方法的建立和溶菌酶与γ干扰素共表达重组腺病毒的构建[D]. 吴倩. 扬州大学, 2016(02)
- [5]表达犬γ干扰素重组乳酸乳球菌的构建及体外抗病毒活性检测[D]. 吴昱. 东北农业大学, 2013(10)
- [6]吉林白鹅α/γIFN原核表达、抗病毒活性及其核酸疫苗免疫佐剂作用的研究[D]. 李公美. 吉林农业大学, 2013(11)
- [7]减毒沙门氏菌介导TGEV S基因与pIL-6基因双顺反子DNA疫苗的构建与免疫原性研究[D]. 李春松. 四川农业大学, 2011(05)
- [8]γ-干扰素的研究进展及在畜牧中的应用[J]. 代丽,单安山,孙进华. 中国畜牧兽医, 2009(04)
- [9]牛γ-干扰素和人溶菌酶共表达载体的构建和表达产物的纯化[D]. 周磊. 扬州大学, 2008(04)
- [10]猪γ-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒作用[J]. 姚清侠,黄勤锋,曹毅,司有辉,钱平,陈焕春. 中国兽医学报, 2008(04)