一、抗肝癌单链双功能抗体在Hut-78细胞系中的表达及体外杀伤活性（论文文献综述）
胡耀凯[1]（2018）在《抗GPC3×CD3双特异性抗体的构建及其抗肝癌活性研究》文中指出肝细胞癌（HCC）是危害人类健康的常见恶性肿瘤,仅在我国肝癌的死亡率就占到了 55%左右。有研究表明,磷脂酰肌醇蛋白-3（GPC3）在一些恶性肿瘤中高度表达,其中在肝细胞癌中的阳性率在60%以上,并且在正常肝组织以及非肝癌组织中不表达。因此,GPC3在临床的诊断和治疗上是一个很有潜力的靶点。GC33是一株特异性靶向GPC3的高亲和力人源化抗体,可通过ADCC功能杀伤GPC3阳性的肝癌细胞,临床Ⅰ期试验证明了 GC33的安全性,但其在临床Ⅱ期的试验中结果却不尽人意,与对照组相比GC33未能延长患者的无进展生存期（PFS）和总生存期（OS）。双特异性抗体能通过CD3靶标招募T细胞到肿瘤部位,特异性的杀伤肿瘤细胞,Fc功能区的保留能够刺激肿瘤微环境的免疫细胞发挥自身抗肿瘤效应。本研究通过基因工程的方法构建了两种不同形式的抗GPC3×CD3双特异性抗体,一种是将单链抗体加在天然抗体轻链的C末端,而另一种则是将天然抗体的可变区替换为单链抗体,并用CHO细胞进行瞬时转染表达,结果发现单链抗体连接在C末端的设计具有更高的抗体表达水平,产量为13mg/L,约是另一种设计抗体表达量的40倍;此外,靶向不同靶标的单链抗体连接在抗体轻链的C末端对于抗体的结合活性有较大的影响,将GC33单链抗体连接在CD3抗体轻链的C末端能够较好的保留针对GPC3和CD3的结合活性,且与亲本抗体的结合活性相当;而CD3单链抗体连接在GC33抗体的轻链C末端则大幅度降低了与CD3靶标的结合活性。最终,CD3K-SCFV-GC33这株双特异性抗体能较好的结合GPC3和CD3靶标,并具有很高的表达水平,通过SDS-PAGE和HPLC分析其纯度也在95%以上。通过对CD3K-SCFV-GC33进行体外的生物活性验证,该双特异性抗体能高效刺激T细胞的激活,并产生较高水平的IL-2和IFN-y,这些细胞因子可以诱导T细胞之外的免疫细胞激活并发挥抗肿瘤功能;在体外细胞杀伤实验中,与GC33相比,CD3K-SCFV-GC33能够在24h快速杀伤肝癌细胞,并在48h的杀伤率为60%以上,约是GC33杀伤率的3倍。在NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型中,活体荧光成像显示CD3K-SCFV-GC33和GC33都具有较好的体内靶向功能,但CD3K-SCFV-GC33表现出更为稳定的体内靶向功能,荧光强度72小时后几乎未出现衰减,并且CD3K-SCFV-GC33抑制肿瘤的生长的效果与GC33相当。因此,本研究成功构建了一株表达量和纯度都较高的抗GPC3×CD3双特异性抗体,并验证了其在体外和体内都具有较好的抗肿瘤功能,为双特异性抗体的设计提供参考方案,也为肝癌的晚期治疗药物的开发提供一种新的手段。
纪洪帅[2]（2018）在《抗B7-H4-scFv/PE38KDEL重组免疫毒素的表达和功能性检测》文中研究指明本研究通过SOE-PCR技术将抗B7-H4单链抗体基因与毒素PE38KDEL基因进行连接,将得到的重组免疫毒素基因anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL亚克隆到原核表达载体pET28a中诱导表达。重组免疫毒素先通过变复性得到可溶蛋白,在经过镍柱纯化得到较单一的目的蛋白,并用免疫印迹鉴定蛋白的表达情况;后分别利用间接ELISA、流式细胞术和Western blot检测重组蛋白与B7-H4抗原的结合活性;通过MTT法和皮下异种移植瘤模型实验,检测毒素蛋白对体外、内肿瘤细胞的抑制作用,处死荷瘤鼠后,解剖瘤块并对肿瘤组织进行HE染色和免疫组化分析。具体实验流程如下:1、重组免疫毒素anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL基因的扩增、克隆和重组表达载体 pET28a/anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL 的构建先分别扩增出单链抗体anti-B7-H4-scFv基因和修饰后的毒素PE38KDEL基因,再利用SOE-PCR技术将这两段基因连接。PCR反应结束后,将目的条带进行割胶回收。将回收的目的基因anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL与pUM19-T Vector按照试剂盒进行T-A克隆,保留测序结果正确的菌株。用EcoRⅠ和NotⅠ限制性内切酶对pET28a（+）质粒和anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL基因进行双酶切。所得的连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中,涂含抗生素的平板进行筛选,次日挑取平板上长出的阳性克隆送测鉴定,测序正确的阳性菌株-80 ℃保存。2、重组免疫毒素Anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL的表达、纯化及活性检测将含有正确 pET28a/anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL 重组载体质粒的 BL21（DE3）表达菌株在不同条件下诱导表达。利用SDS-PAGE分析蛋白在不同条件下的表达情况,并找出最优表达条件。在最优的条件下扩大培养并收集产物,将所得的包涵体沉淀进行变复性处理,以获得更多的可溶性上清。表达产物带有His标签可与镍柱结合,以此纯化蛋白,并用不同浓度的咪唑洗脱并收集洗脱液。把洗脱的蛋白液进行透析,浓缩,收集及鉴定。间接ELISA鉴定重组毒素蛋白和B7-H4抗原蛋白的亲和活性;采用间接荧光标记的方法,运用流式细胞术检测免疫毒素对人源乳腺癌细胞MCF-7、正常人肾皮细胞293a和人源肝癌细胞HepG2这3种细胞的结合活性。3、重组毒素蛋白Anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL在体外和体内的生物学功能鉴定分别从体内和体外两部分实验检测重组毒素蛋白的生物学功能,体外利用MTT 实验在 5 个浓度梯度（0.01、0.10、1.00、10、100ug/ml）下,分别在 12h、24h、36h和48h测定重组毒素对B7-H4抗原高表达的肺癌细胞A549、少表达的肝癌细胞HepG2和不表达的正常细胞293T细这三种细胞增殖的影响。利用台盼蓝染色检测毒素蛋白（0.01、1.00、100 ug/ml）对MCF-7、HepG2、293a三种细胞的作用,并计算存活率。体内实验建立小鼠肿瘤异种移植模型,将人源肺癌A549细胞调整到一定数量注射到小鼠皮下建立模型,待瘤长到一定大小时,随机分为空白对照组、阳性对照组和实验组,空白对照组注射生理盐水,阳性对照组注射紫杉醇,实验组注射抗体蛋白,连续隔天给药,一共注射七次,期间记录小鼠体重和肿瘤体积变化。最后处死荷瘤鼠,对取出的瘤组织进行称重、固定,并进行HE染色和免疫组织化学分析。
田智[3]（2012）在《pVAX1/SjscFv-IL18对日本血吸虫病肝纤维化的影响及其作用机制的研究》文中指出研究背景血吸虫病（schistosomiasis）是一种流行广泛、严重危害人类健康和社会经济发展的人兽共患寄生虫病,我国是日本血吸虫病（schistosomiasis japonica）流行最严重的四个国家之一。日本血吸虫（Schistosoma japonicum, Sj）致病的主要原因是雌虫产出的大量虫卵沉积于肝、肠等组织中,形成虫卵肉芽肿、组织损伤和继发性肝纤维化。肝纤维化的进一步发展导致肝硬化,患者可因上消化道出血、肝性昏迷等严重并发症而致死。因此,阻止虫卵肉芽肿病变的形成,对于控制日本血吸虫病的进程、防止晚期血吸虫病的发生具有重要的意义。目前,临床上采用单一的吡喹酮治疗血吸虫病仍存在一定缺陷,吡喹酮只能杀灭童虫和成虫,而不能阻止肝组织内的虫卵继续分泌抗原,虫卵可溶性抗原（soluble matured egg antigen, SEA）可引起组织内虫卵肉芽肿反应,由于血吸虫病患者发现时多己转为慢性,肝组织内虫卵已经或正在形成虫卵肉芽肿或肝纤维化,有效杀虫治疗后病人依然有转化为晚期的可能,SEA诱导产生的免疫病理反应并不因杀虫治疗而终止。IL-18是目前己知的对血吸虫病肝纤维化具有治疗作用的细胞因子,然而单纯使用细胞因子治疗需连续、大剂量的用药,势必导致毒副作用的增加以及宿主体内细胞因子的严重失衡。因此,我们拟利用实验室前期筛选得到的对日本血吸虫雌虫、未成熟虫卵、成熟虫卵等多个阶段均具有高特异性免疫靶向作用及识别能力的单链抗体（Sj single-chain Fv antibody, SjscFv）,将其与对血吸虫性肝纤维化具有治疗作用的细胞因子IL-18融合表达,产生SjscFv-IL18融合蛋白,借助SjscFv的免疫及靶向作用携带IL-18进入虫卵肉芽肿和肝纤维化形成的局部,特异性提高局部免疫作用及IL-18浓度,诱导日本血吸虫感染慢性期从Th2型免疫应答转化为Th1型优势的免疫应答,同时能够极大地降低IL-18对其它正常组织器官的毒副作用,以期达到更好的抗日本血吸虫性病纤维化的效果。研究目的构建真核重组质粒pVAX1/SjscFv-IL18,转染巨噬细胞后,使用SEA刺激后的巨噬细胞上清液处理肝星状细胞（HSCs）,观察对HSCs激活、增殖和凋亡的影响,并检测HSCs中与细胞外基质（ECM）沉积相关的基因表达,评估其抗肝纤维化的能力；并在日本血吸虫病肝纤维化小鼠中研究其对虫卵肉芽肿及肝纤维化形成的影响及其作用机制。研究方法1、真核重组质粒pVAX1/SjscFv-IL18的构建；采用SOE-PCR技术构建重组质粒pVAX1/SjscFv-IL18和pVAX1/S/scFv,转化大肠杆菌后,进行大量表达,并通过双酶切和测序鉴定,使用生物信息学方法分析其结构特征。2、pVAX1/SjscFv-IL18对HSCs胶原生成与降解的影响将各组重组真核质粒转染巨噬细胞后,采用SEA刺激巨噬细胞后的上清液处理HSCs,应用实时荧光定量PCR（qPCR）检测胶原相关基因mRNA水平、MTT检测HSCs细胞增殖、流式细胞术检测HSCs凋亡。3、pVAX1/SjscFv-IL18对日本血吸虫病肝纤维化的影响建立日本血吸虫病肝纤维化小鼠模型,将pVAX1/SjscFv-IL18注入小鼠体内,采用]HE、Masson染色方法分别检测肝组织内虫卵肉芽肿的大小、肝组织内胶原沉积的情况,应用ELISA检测小鼠Thl/Th2型细胞因子、IL-18,免疫组化检测肝组织中TGF β1和IL-18, qPCR检测肝脏中胶原相关基因mRNA水平。研究结果1、PCR、双酶切及测序结果显示重组质粒插入序列与目的序列一致,CD-Search证实所构建质粒表达蛋白中包含目的蛋白所需的两个Ig超家族和IL-1超家族保守结构域,说明真核重组质粒pVAX1/SjscFv-IL18构建成功。2. pVAX1/SjscFv-IL18转染巨噬细胞后,采用SEA刺激该巨噬细胞产生的上清液处理HSCs,与对照组相比,能够部分降低HSCs中a-SMA的mRNA水平,并抑制HSCs增殖、促进HSCs凋亡,上调MMPs-1的同时下调Col Ⅰ、Col Ⅲ和TIMP-1的mRNA表达。3、pVAX1/SjscFv-IL18注入日本血吸虫病肝纤维化小鼠后,能够降低肝组织内虫卵肉芽肿的大小,减少肝组织内胶原的沉积,并在体内表达大量的IL18,诱导Thl型优势的免疫反应,减少肝脏中TGF β1表达,上调MMPs-1的同时下调Col Ⅰ、Col Ⅲ和TIMP-1的mRNA表达,且能够在虫卵肉芽肿局部提高IL-18的浓度,从而产生更好的抗日本血吸虫病肝纤维化的作用。结论1、成功构建了真核重组质粒pVAX1/SjscFv-IL18。2、pVAX1/SjscFv-IL18在体外能够通过影响巨噬细胞内细胞因子的分泌进而抑制HSCs中胶原的生成,促进胶原降解。3、pVAX1/SjscFv-IL18能够通过SjscFv的免疫靶向作用提高IL-18的生物学活性,从而抑制虫卵肉芽肿的形成,并产生更好的抗日本血吸虫病肝纤维化的作用。
陈昌友[4]（2011）在《抗人CD80单链抗体（ScFv）及双价抗体（diabody）的研制及生物学功能初步研究》文中进行了进一步梳理CD80（也称B7-1）是B7家族重要的共刺激分子。人CD80分子编码基因定位于人类染色体3q13.3-q21区内,含有1491bp。CD80是分子量约为44-54kD的Ⅰ型跨膜糖蛋白,主要表达在专职性抗原提呈细胞（antigen-presenting cell,APC）树突状细胞、单核-巨噬细胞及B淋巴细胞。CD80分子的配体为表达在T淋巴细胞表面的CD28和CTLA-4。CD80与CD28结合为T细胞的活化提供第二信号,促进T细胞的增殖与分化;而与CTLA-4结合介导抑制信号,从而下调或终止T细胞效应。若缺乏此共刺激信号,抗原特异性的第一信号非但不能有效激活特异性T细胞,反而导致T细胞无能,或者耐受。研究表明,CD80介导的信号通路不仅能调节T细胞活化过程,而且还参与许多疾病的发生发展及预后状况。单链抗体（single-chain variable fragment,ScFv）是一种小分子的抗体,含有完整的抗原结合位点,由重链可变区（the variable heavy chain,VH）和轻链可变区（the variable light chain,VL）通过一段连接肽连接而成,大小为26-28kDa。VH和VL之间的连接肽长度为10-25个氨基酸,最为普遍的为（Gly4Ser）3十五肽。Diabody是单链抗体的二聚体形式,是通过将单链抗体VH和VL之间的连接肽缩短至3-10个氨基酸时,可促进分子间VH和VL的配对而形成。第一部分抗人CD80单链抗体（ScFv）的研制及生物学功能初步研究1.目的:构建及表达抗人CD80单链抗体（ScFv）,鉴定其抗原抗体结合活性,并初步研究其生物学功能。2.方法:采用RT-PCR法从分泌鼠抗人CD80 McAb的杂交瘤细胞株（4E5）中克隆VH和VL基因。用重叠延伸拼接PCR方法构建具有前导肽的L-VH-Linker-VL单链抗体基因,并克隆至pIRES2-EGFP表达载体,脂质体法转染中华仓鼠卵巢细胞（CHO）,G418加压筛选。纯化抗人CD80-ScFv,分析其效价,并鉴定其对膜型CD80的识别。竞争抑制实验分析抗人CD80-ScFv与相应抗原的结合能力。MTT法体外分析抗人CD80-ScFv对Raji细胞体外增殖的抑制作用和对CD80介导的共刺激信号的阻断作用。3.结果:构建的抗人CD80-ScFv基因全长为828bp,经测序含有信号肽和连接肽编码基因。实验获得稳定分泌细胞株（命名为SA-Ⅱ）。上清中抗体得率为15.12mg/L,相对效价为2.0μg/5×105个细胞。该抗体与天然表达CD80分子的Raji和Daudi细胞阳性结合率分别为96.6%和95.0%。抗人CD80-ScFv对鼠源亲本抗体4E5与抗原结合的竞争抑制率达98.67%,并能抑制Raji细胞的体外增殖,而且能阻断CD80介导的共刺激信号转导,抑制PBMC的增殖,增殖率下降43.48%。4.结论:成功构建的表达抗人CD80-ScFv的细胞株,其分泌的抗体具有良好的生物学活性。该抗体的研制在CD80及相关分子的基础或/及临床研究中具有重要的应用价值。第二部分抗人CD80双价抗体（diabody）的研制及生物学功能初步研究1.目的:构建及表达抗人CD80双价抗体（diabody）,并初步研究其生物学功能。2.方法:PCR法获得轻重链可变区基因,构建表达载体pIRES2- EGFP/diabody。将pIRES2-EGFP/diabody转染中华仓鼠卵巢细胞（CHO）,G418加压,筛选稳定高表达细胞株,扩大培养并收集上清,经镍柱纯化,并经变性及非变性SDS-PAGE电泳对抗体分子的双体性进行鉴定。以鼠源性亲本抗体4E5为对照,测定抗人CD80-diabody的效价。采用免疫荧光及流式细胞术（FCM）分析抗体与细胞膜型CD80分子的结合活性及与鼠源性亲本抗体4E5的竞争抑制效应;MTT法分析该抗体对天然高表达CD80的Raji细胞体外增殖的影响,同时分析其对CD80介导的共刺激信号阻断作用的影响。3.结果:成功构建抗人CD80-diabody表达载体,基因全长为798bp,含有信号肽和Gly4Ser连接肽编码基因。获得了稳定分泌双价抗体的细胞株（命名为SA-Ⅲ）,培养上清中纯化抗体的得率为15mg/L,PAGE结果显示其为一个二聚体,Mr约为53kD（a抗人CD80-ScFv Mr约为27kDa）。抗人CD80-diabody的效价为1.5μg/5×105个细胞,与L929-CD80、Raji及Daudi的阳性结合率分别为96.5%、98.1%及93.0%;该抗体对鼠源亲本抗体4E5与抗原结合的抑制率为97.11%,对Raji细胞体外增殖的抑制率达31.27%。同时也能阻断CD80介导的共刺激信号。与单链抗体相比,亲和活性明显提高。4.结论:成功获得了分泌抗人CD80-diabody的CHO细胞株,该抗体具有良好的生物学活性,亲和活性较单链抗体也明显提高,为进一步对CD80分子的研究奠定了基础。
洪智慧[5]（2011）在《131Ⅰ标记抗胃泌素释放肽前体单链抗体scFv的实验研究》文中研究指明研究目的:研究（131）I标记抗胃泌素释放肽前体( Pro-gastrin-releasing peptide（31-98）, ProGRP（31-98）)单链抗体scFv在正常昆明小鼠及荷小细胞肺癌裸鼠的体内分布规律,并对荷小细胞肺癌裸鼠进行初步显像,探讨（131）I-anti-ProGRP（31-98） scFv作为特定肿瘤显像剂的可能性。研究方法:1.利用流式细胞仪和免疫组化两种方法分别检测小细胞肺癌NCI-H446、宫颈癌Hela、大细胞肺癌H460和肺腺癌A549细胞株及其组织中的ProGRP表达情况。2.采用氯胺-T法标记制备（131）I-anti-ProGRP（31-98） scFv;凝胶柱分离法分离纯化标记产物;纸层析法测定标记产物的标记率、放化纯;将（131）I-anti-ProGRP（31-98）scFv分别置于37℃水浴箱及与正常人血清混合后在不同时间点测定放化纯以了解其稳定性;通过细胞结合分析法测定标记产物的免疫活性。3.自正常昆明小鼠尾静脉注射（131）I-anti-ProGRP（31-98） scFv后,于不同时间点剪断颈动脉处死小鼠,取血液及各主要脏器组织标本,计算每克组织注射百分剂量率（%ID/g）。利用NCI-H446细胞建立人小细胞肺癌荷瘤裸鼠模型,自尾静脉注射（131）I-anti-ProGRP（31-98） scFv后,于不同时间点处死裸鼠并取血液、移植瘤及各主要脏器组织标本,计算不同时间点各脏器组织的%ID/g和瘤体/非瘤体组织放射性计数比值（T/NT值）。4.对小细胞肺癌荷瘤裸鼠模型进行（131）I-anti-ProGRP（31-98） scFv初步显像,观察移植瘤的大体显像情况,利用ROI技术在显像图上勾画移植瘤轮廓并计算瘤体与对侧相同部位的T/B值。研究结果:1.流式细胞仪检测显示NCI-H446、Hela、H460及A549细胞株ProGRP的表达率分别为95%、77%、53%和4%。免疫组化检测结果显示,小细胞肺癌、宫颈癌及大细胞肺癌组织切片的细胞胞浆内均有二氨基联苯胺（DAB）染色阳性颗粒分布,而肺腺癌组织切片中未见明显染色阳性细胞。2. （131）I-anti-ProGRP（31-98） scFv标记率为93.35±0.67%,标记产物纯化后即刻放化纯为98.49±1.21%;在37℃水浴箱中放置24 h后放化纯为94.30±0.41%,48 h后测定仍大于90%,与正常人血清充分混合在37℃水浴箱中放置24 h后放化纯为83.61±2.19%,48 h测定大于80%;（131）I-anti-ProGRP（31-98） scFv对NCI-H446和A549细胞株的免疫结合率分别为85.36%、21.02%。3. （131）I-anti-ProGRP（31-98） scFv在正常昆明小鼠和小细胞肺癌荷瘤裸鼠体内主要通过肝脏、肾脏代谢,血液及各主要脏器组织的清除速度快,脑组织和肌肉组织摄取不明显,符合单链抗体在机体内的一般代谢分布规律。注射12 h后移植瘤体的%ID/g高于其他脏器及组织,24 h达到最高为5.38±0.92%。T/NT值随时间的延长逐渐升高,至注射后24 h基本达到最高。4.注射（131）I-anti-ProGRP（31-98） scFv 1 h后,小细胞肺癌移植瘤部位出现放射性浓聚,随时间延长移植瘤部位的放射性浓聚程度逐渐增强,至24 h最为清晰。结论:1. （131）I-anti-ProGRP（31-98） scFv标记简便,标记率及放化纯高,体内外稳定性好,主要通过肝肾代谢,血液及各主要脏器廓清速度较快。2. （131）I-anti-ProGRP（31-98） scFv在小细胞肺癌荷瘤裸鼠体内的分布结果表明,它可在移植瘤组织内积聚,瘤体与主要器官的T/NT值随时间延长而上升,至24 h到达最高值。3. （131）I-anti-ProGRP（31-98） scFv有望成为一种新型的小细胞肺癌放射免疫显像剂,值得进一步深入的研究。
陶俊[6]（2010）在《人源性抗FGF-2中和性抗体的筛选，表达及鉴定》文中研究表明目的和背景FGF-2又称为碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,FGF-2）,是成纤维生长因子家族的一员,最早由Gospodarowicz （1974）从牛脑垂体中提取的一种对BALB／C 3T3细胞等有明显促进生长作用的细胞因子。FGF-2有五种分子量,从18kD到34kD不等。所有的FGF-2异构体都缺乏信号肽,是通过一种现在还不十分清楚的机制分泌到细胞外的,其中18kD FGF-2在体内分布广泛,存在于中胚层及神经外胚层来源的细胞及多种肿瘤细胞中,对这些细胞有促增殖分化功能,参与了胚胎发育、血管生成、损伤修复、神经再生、肿瘤生长、组织纤维化等多项生理及病理过程。FGF-2的生物学效应,除对成纤维细胞和血管内皮细胞具有显着的促增殖作用外,还参与肿瘤发生和发展,特别对肿瘤的浸润和转移具有重要作用。有相当部分的肿瘤（如乳癌、结肠癌、甲状腺癌、肺癌、膀胱癌、食道癌等）存在FGF-2的高表达（表2）。已知其作用环节主要有（1）FGF-2能促进表皮、内皮细胞再生,促进血管内皮细胞分裂,诱导其从基膜中分离出来,以刺激内皮细胞向肿瘤组织趋化运动,并形成管状结构,还提高组织中血纤维蛋白溶解酶原激活因子类及诱导内皮细胞产生其他蛋白酶,从而促进毛细血管的形成；（2）FGF-2能促进多种生长因子的分泌,如VEGF、HGF、FGF-1等,这些因子相互调节,共同促进肿瘤的生长；（3）肿瘤细胞存在FGF-2受体的高表达,通常比正常细胞上FGF-2R高10倍以上,许多肿瘤细胞（如神经胶质瘤、横纹肌肉瘤、白血病、肺瘤、黑色素瘤、肝癌等）既表达FGF2又表达FGFRs,因此FGF2可直接作用于肿瘤细胞,使肿瘤织的各种蛋白酶及胶原酸分泌增加,从而加速肿瘤细胞的转移过程；（4）FGF-2还与肿瘤的耐药性有关,增强肿瘤对药物诱导的细胞凋亡的抵抗能力[20]。故FGF-2与肿瘤生长、转移、预后有着非常密切的关系。FGF-2与肿瘤肿瘤生长、转移、耐药有关,用抗体阻断FGF-2的活性被认为是一种治疗肿瘤的有效方法。已有多株抗FGF-2抗体体内外抑制肿瘤试验的报道。在多种动物体内,一株中和性的的单抗（GD2）能抑制FGF-2或肿瘤组织诱导的血管新生。在大鼠体内内GD2能抑制骨肉瘤的生长。另一株单抗,3H3,能抑制十二指肠溃疡的血管新生,从而延迟溃疡的愈合,同时它还能抑制一种转染的致瘤性细胞在裸鼠体内的生长。Aonuma等制备了两株中和性单抗,2G11和1E6,前者识别的是FGF-2的肝素结合位点,后者识别的是FGF-2与受体结合的位点,体内实验证实1E6能抑制肿瘤生长,而2G11不具备抗瘤作用。国内,谢庆祥等[7]通过建立裸鼠皮下移植膀胱癌动物模型进行研究,发现FGF-2抗体治疗组皮下瘤体积和重量比对照组均显着减少,瘤组织中增殖细胞核抗原（PCNA）指数和微血管密度（MVD）也显着降低,表明FGF-2抗体对膀胱癌的生长具有明显抑制作用,其主要通过抑制膀胱癌细胞增殖和减少肿瘤血管形成的途径而在荷瘤裸鼠体内发挥抗肿瘤作用。林卫等观察了FGF-2抗体对人卵巢癌细胞的增殖、卵巢癌腹腔移植瘤裸鼠的生存率和人卵巢癌移植瘤血管生成和肿瘤生长的影响。研究结果显示,FGF-2抗体能明显抑制卵巢癌细胞的增殖,卵巢癌的生长和血管生成,并呈浓度依赖性,提示FGF-2单抗有望成为卵巢癌生物治疗的新方法。本实验室前期制备了19株鼠抗FGF-2单抗,通过体外实验证实,其中三株抗体能够诱导B16细胞凋亡,近期的体内试验发现其中一株抗体能够明显抑制黑色素瘤的生长和转移,延长荷瘤小鼠的生存期,同时与化疗药物顺铂、紫杉醇等联合使用能够明显抑制黑色素癌的生长,而对于那些对化疗药物耐药的肿瘤抗FGF-2单抗能逆转其耐药性。这些报道证实在多种试验条件下,抗FGF-2抗体能阻断血管新生和抑制肿瘤生长。但这些抗体都是动物来源的抗体,用于人类疾病的治疗存在半衰期短、血清病发生率高、易在人体内产生抗体导致不能重复使用等弊。制备全人源性的抗FGF-2抗体,是克服上述弊端有效方法。人源性抗体的制备技术主要有三种,第一种是通过表面展示技术从人源性抗体库中筛选人源性抗体,第二种技术是通过免疫转入人免疫球蛋白基因的转基因鼠来获得针对特异抗原的人源性抗体,第三种技术是通过细胞分选技术,从某些病人骨髓细胞或外周血细胞中筛选特异性针对某种抗原的B细胞或记忆性B细胞,通过某些技术如与人骨髓瘤融合或用EB病毒使其永生化,使得这些B细胞能在体外无限繁殖,从而分泌人源性抗体。这三种技术中第二种技术需要购买或构建转基因小鼠,需要耗费大量财力和物力。第三种技术需要特殊病人的血细胞,并且需要获得人源性杂交瘤或刺激B细胞的永生化,这些技术目前还不成熟。表面展示技术具有极强的筛选功能,将序列互不相同的一组多样化的抗体表达到细菌,酵母,病毒表面,得到抗体展示库因此,利用其表型与基因型的统一以及易于扩增的特性,可很容易的从库中筛选出针对某种特异抗原的抗体。其中以噬菌体展示技术应用最为广泛。从噬菌体抗体库中直接筛选获得高亲和力抗体,其主要影响因素是抗体库容量大小和抗体基因的成熟度,其多样性要能保证有这种抗体存,并且在经过扩增后具有被筛选出来所要求的拷贝数,因此增加噬菌体抗体库的库容量尤其重要。根据已有报道,从大于109的大容量天然抗体库中,往往可以得到高亲和力的抗体,无需进行抗体亲和力成熟。本研究所用的抗体库为经过单载体细胞内重组法（Lxop-cre定位重组系统）两次重组配对后的人源性大容量抗体库,重组后库容约为6×1010,沉淀浓缩后滴度约为1013cfu／ml,具有良好的多样性,可以充分满足筛选的需要,在获得高亲和力抗体以及进行抗体性能改造方面具有较强的优势。在抗体的进化过程中,基因突变并不是随机发生于可变区内的,而是倾向性的集中在CDR区的某些位置,即突变热点,有多种类型,其中研究较详细的热点类型有AGY／RGYW和TAY（R=A／G,Y=C／T,W=A／T）。这些位点也常常是位于和抗原直接结合的区域中。针对这类位点引入突变,相较于这类位点之外的区域将更可能得到亲和力提高的基因工程抗体,而且可以通过构建小型的突变库来实现。Ho等研究发现,CDR区的突变热点分为胚系热点和非胚系热点,只有突变胚系热点才能提高抗体的亲和力。因此对抗体胚系热点进行突变将是本文采取的方法。方法1.利用固相筛选技术从大容量噬菌体抗体库（6×1010）中筛选能特异性结FGF-2的克隆,经过三到四轮的洗脱筛选,将得到的阳性克隆通过酶切鉴定,可变区多样性分析,基因测序和序列比对,确定能特异性结合FGF-2的序列正确的阳性克隆。2.将测序正确的阳性克隆的基因插入到原核表达载体pComb3XSS中,在低温培养条件下,利用IPTG诱导scFv基因的可溶性表达,离心后收集菌体,PBS重悬后超声破碎,收集破碎上清,通过SDS-PAGE, Western-blot, ELISA鉴定上清中抗体的特异性,通过竞争ELISA检测者几株scFv能否抑制FGF-2与其高亲和力受体FGFR1的结合。3.将能够抑制FGF-2与其高亲和力受体FGFR1的结合的44克隆通过重叠延伸PCR构建成全长的人源性抗FGF-2抗体,插入到真核表达载体pIGG中,构建成真和表达载体pIGG-44,利用转染试剂FuGene HD转染HEK293T细胞,进行真核可溶性表达,收集细胞培养上清,通过SDS-PAGE, Western-blot,ELISA鉴定上清中抗体的特异性,通过硫酸铵沉淀和蛋白G纯化抗体,通过夹心ELISA测定抗体的浓度。4.表达的全长的人源性抗体通过体外细胞实验验证抗体的中和FGF-2的活性,通过血管内皮细胞促增值实验,迁移实验和成管实验验证抗体对血管内皮细胞的作用,通过肿瘤细胞增殖抑制试验验证抗体对肿瘤细胞的增值抑制作用,通过Hoechst 33258染色观察抗体作用后肿瘤细胞细胞核的变化情况,来观察细胞是否发上了凋亡5.对具有中和活性的44号克隆进行亲和力成熟,利用基因比对从Genebank中搜索出与44号克隆序列最接近的抗体胚系基因序列,然后通过IMTG中的抗体可变区基因在线分析工具V-QUEST,找出重链胚系基因中CDR区的突变热点,并与44号克隆进行比较,确定这些热点在44号克隆重链CDR区中的位置,随后我们通过定点突变对重链可变区CDR1区中的三个胚系热点进行定点随机突变,构建噬菌体抗体突变库,通过三轮洗脱筛选,每轮逐渐增加洗脱次数和减少包被的FGF-2的量来得到亲和力提高的抗体突变株,将高亲和力突变株进行可溶性表达后,通过异硫氰酸铵洗脱法测定抗体的相对亲和力。计算抗体亲和力提高倍数。同时通过竞争ELISA法检测突变株是否还能抑制FGF-2与其高亲和力受体FGFR1的结合。结果1.经过3到4轮筛选从104个随机挑选的克隆中,筛得39株抗FGF-2的抗体,通过对抗体可变区基因多样性分析,发现有8种不同抗体可变区基因型,挑选其中8株phage ELISA显色最高的克隆进行DNA酶切和测序鉴定,发现其中7株为正确的抗体基因序列,通过大肠杆菌HB2151成功的进行了scFv的可溶性表达,通过竞争ELISA发现其中三株scFv能够抑制FGF-2与其高亲和力受体FGFR1βⅢC的结合,其中44号克隆的抑制效果最好。2.通过对转染试剂,转染方法,培养温度,转染试剂与细胞的孵育时间,组蛋白抑制剂的加入等条件进行优化使人源性抗FGF-2抗体在HEK293T细胞中的表达量从1.5mg／L提高到了15.1mg／L。表达产物经硫酸铵沉淀,透析后上蛋白G亲和层析柱纯化,纯化后的产物经超滤管超滤除盐,最后经SDS-PAGE鉴定,获得纯度为90%的电泳纯抗体,双抗夹心法测定抗体含量,显示产量可以达到每升细胞培养上清12mg抗体。3.通过一系列体外实验证实44号克隆能够抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖,迁移和成管,同时还能抑制神经胶质瘤细胞株U87MG的增殖,Hoechst 33258染色后发现抗FGF-2抗体作用能够诱导U87MG的凋亡4.通过热点随机突变构建44号克隆的单链抗体噬菌体突变库,通过三轮洗脱筛选,筛选到了4株亲和力提高的抗体突变株,经过可溶性表达后,通过异硫氰酸铵洗脱法测定抗体的相对亲和力,显示其中最高的一株亲和力比44号克隆的亲和力提高了4倍。结论1.通过对人源性噬菌体抗体库的筛选得到了七株不同的人源性抗FGF-2抗体,经过体外实验证实其中一株抗体能够中和FGF-2的多种生物学作用,如促血管内皮增殖作用,促细胞迁移作用,内皮细胞成管作用等,更为重要的此株抗体还能诱导神经胶质瘤细胞株U87MG的凋亡。2.通过胚系热点突变使此株中和性抗体的亲和力提高了4倍,与此同时也提高了抗体的中和活性,从而证实了胚系热点突变提高抗体亲和力的可行性。本研究的创新处：1.成功筛选到三株人源性中和性抗FGF-2抗体,其中一株的抑制FGF-2与其高亲和力受体FGFR1结合的效果最好,通过细胞实验证实此株抗体能够中和FGF-2的多种生物学作用,为FGF-2抗体药物研究奠定基础。2.成功利用CDR区胚系热点突变提高了一株中和性抗体的亲和力,同时也使得抗体的中和活性增强,证实了此方法可在不改变抗原识别位点的情况下提高抗体的亲和力。
张伟伟[7]（2010）在《西维因单链抗体基因克隆、表达及活性分析》文中研究表明本研究从106-107个分泌西维因抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,反转录成cDNA,利用兼并引物分别扩增出抗体轻链可变区（VL）和重链可变区（VH）基因,对其进行测序鉴定,确定其为小鼠抗体可变区片段,片段大小分别为324bp和360bp。根据基因序列重新设计特异性引物,重叠延伸PCR扩增出单链抗体（scFv）基因片段,经测序鉴定,片段连接正确,长度为729bp。将此scFv与表达载体pET30a连接,构建重组表达质粒scFv-pET30ao转化大肠杆菌BL21（DE3）.利用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE检测结果表明获得重组表达抗体,分子量大小约为33kDa,但是形成包涵体。采用透析法对包涵体进行复性,并对复性条件进行优化,结果显示最佳复性时间为48h,最佳起始蛋白浓度为200μg/mL,含有精氨酸的复性液效果最佳。利用亲和层析纯化scFv,并利用直接竞争ELISA检测其活性,结果显示该scFv对西维因具有良好的亲和性和特异性。为了获得活性更好的基因工程抗体,本研究还在表达载体和信号肽方面探索,期望获得可溶性重组抗体。本研究重新设计引物,从构建成功的scFv-pET30a质粒中重新扩增了scFv,并将其与可溶性表达载体pET26b进行酶切连接,转化大肠杆菌BL21（DE3）,在20℃,不同IPTG浓度下,进行诱导表达12h, SDS-PAGE检测结果表明,0.05mmol/L IPTG浓度下有少量可溶性表达,分子量大小约为30kDa,在此条件下,大量制备可溶性抗体,用亲和层析柱纯化后,直接竞争ELISA检测发现这一抗体与复性抗体相比,在特异性和稳定性方面没有优势。本研究还尝试了将有机磷农药降解酶（OPH）基因信号肽序列插入scFv-pET26b质粒,构建了OPH-scFv-pET26b重组质粒,并将其转化大肠杆菌BL21（DE3）,在20℃不同IPTG浓度下进行诱导表达12h, SDS-PAGE检测菌体破碎后的上清液中没有可溶性抗体的表达,重组蛋白形成了包涵体,分子量大小约为40kDa。
苏醒[8]（2008）在《抗黑色素瘤scFv-mTNF-α免疫细胞因子的构建及其抗肿瘤活性研究》文中研究说明目的:构建抗黑色素瘤免疫细胞因子ScFv-mTNF-α,在大肠杆菌中表达并纯化具有黑色素瘤特异性结合活性和杀伤活性的融合蛋白,为黑色素瘤的抗体导向治疗打下基础。方法:为了避免使用天然型TNF-α所造成的强烈的副作用,我们尝试用高生物学活性、低毒性的突变型TNF-α（mTNF-α）将天然型TNF-α替代,与抗黑色素瘤单链抗体构建新型、高效、低毒的抗黑色素瘤免疫细胞因子原核表达载体pGEX4T-1/ScFv-mTNF-α,待鉴定正确后,通过在大肠杆菌中诱导表达、纯化,用制备的融合蛋白在体外对L929细胞进行TNF活性的检测,对B16-F10黑色素瘤细胞进行体外杀伤实验,在体内对荷黑色素瘤Balb/c小鼠进行导向治疗研究,以期获得具有临床应用潜能的抗黑色素瘤免疫细胞因子。首先鉴定本室保存的两个质粒pGEX-4T-1/ScFv和pGEX-4T-1/mTNF-α,并对其进行测序,用获得的测序结果推导出对应的氨基酸序列,查阅文献获得linker序列,将模拟得到的理论融合蛋白片断通过Insight II软件,采用同源建模、分子力学和分子动力学等方法预测蛋白质三维结构。设计含有限制性内切酶和linker序列的引物并分别扩增ScFv基因和mTNF-α基因,用重叠延伸PCR方法把ScFv基因与mTNF-α基因进行融合,将所获得的免疫细胞因子基因克隆入带GST标签的质粒pGEX-4T-1中,构建原核表达载体pGEX4T-1/ScFv-mTNF-α,用限制性内切酶酶切分析、DNA序列测定、SDS-PAGE和Western blot鉴定融合蛋白原核表达载体构建和表达的情况。IPTG诱导表达之后的表达产物经包涵体的纯化→变性→复性→透析→浓缩→亲和层析后,得到比较纯的ScFv-mTNF-α的抗黑色素瘤的融合蛋白。采用MTT法,标准曲线法用小鼠成纤维细胞L929检测免疫细胞因子的TNF-α活性;MTT法检测免疫细胞因子对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞株的杀伤作用;免疫荧光测定ScFv对黑色素瘤细胞的特异结合活性;体内实验用Balb/c小鼠尾静脉注射小鼠黑色素瘤细胞株B16-F10,实验分为PBS组、ScFv组、mTNF-α组、ScFv-mTNF-α四组,每组8只动物。接种一天后开始尾静脉注射给药,连续给药一个星期,每24h一次,给药量为60ug/只·天,一周后解剖各组小鼠进行比较,观察小鼠肺部黑色素瘤转移的情况。结果:质粒pGEX-4T-1/ScFv经过测序后ScFv基因长732bp,基因内无终止码,为开放读框,编码244个氨基酸,含六个CDR区,并含有维持抗体结构所必需的四个半胱氨酸。计算机分析与已发表的小鼠抗体可变区基因有较高同源性,表明所克隆基因为功能性重排小鼠抗体可变区基因。mTNF-α基因与天然型TNF-α基因比较,缺少了7个N端氨基酸的同时Pro8Ser9Asp10改也变为ArgLysArg,C端第157位Leu由疏水性氨基酸Phe替代。根据文献确定linker序列为GTGGGS,将ScFv与mTNF-α基因融合后对获得的理论融合蛋白的序列进行三级结构预测,结果显示融合蛋白单体和形成三聚体后的ScFv与mTNF-α彼此功能结构域不会互相影响。PCR扩增出ScFv和mTNF-α基因片断,通过OE-PCR方法将两个片断进行融合,构建了原核表达质粒pGEX-4T-1/ScFv-mTNF-α,转化大肠杆菌TG1,经IPTG诱导在分子量为69KD处有一条明显的新生蛋白带,用抗GST单抗进行Western blot分析也证实了该新生蛋白带为GST-ScFv-mTNF-α融合蛋白。表达产物经包涵体的纯化→变性→复性→透析→浓缩→亲和层析→凝血酶切→亲和层析后,得到比较纯的ScFv-TNF-α的抗黑色素瘤的免疫细胞因子。在ScFv-mTNF-α的MTT实验中,我们发现ScFv-mTNF-α对TNF敏感的小鼠成纤维细胞L929具有明显的杀伤作用,测得免疫细胞因子的mTNF-α活性为34382 u/mg,表明融合蛋白的mTNF-α端具有良好的生物学活性;免疫荧光实验结果表明scFv具有良好的与黑色素瘤细胞结合的特异性;对B16-F10细胞株的杀伤实验表明免疫细胞因子具有体外结合并杀伤黑色素瘤细胞的特性,杀伤效应存在浓度依赖关系,即融合蛋白浓度越大,对细胞的杀伤越强,浓度在100μg/ml时对B16-F10细胞的杀伤效果最佳。B16-F10接种的各组Balb/c小鼠在经过一周的治疗后肺表面均没有明显的黑色素瘤转移结节,PBS对照组也没有发现肺部肿瘤转移灶形成,可能的原因是B16-F10对Balb/c小鼠有较强的免疫原性。因此我们将实验进行了改进,改用C57/BL6小鼠,延长实验周期,即延长肿瘤转移后的生长时间,再对其采用融合蛋白进行治疗,观察融合蛋白在体内对黑色素瘤的杀伤效应。实验正在进行中。结论:成功构建了抗黑色素瘤免疫细胞因子pGEX4T-1/ScFv-mTNF-α原核表达载体,用获得的融合蛋白进行体内外活性研究,实验结果表明免疫细胞因子ScFv-mTNFα具有较好的体外生物学活性。
卢筱华[9]（2006）在《抗肝癌单链抗体的体外亲和力成熟研究》文中认为第一部分 抗肝癌噬菌体单链抗体突变库的构建和筛选 目的：体外模拟抗体体内成熟过程，构建抗肝癌噬菌体单链抗体突变库，并从中筛选出与肝癌细胞特异性结合的单链抗体。 方法：采用错配PCR和DNA改组技术依次对原始抗肝癌单链抗体A4-16重链可变区和轻链可变区分别进行突变构建抗肝癌噬菌体单链抗体突变库；利用噬菌体展示技术对突变库进行4轮富集筛淘及ELISA鉴定；以ELISA方法测定所获阳性克隆的特异性。 结果：成功构建了抗肝癌噬菌体单链抗体突变库，目的基因插入率为91％，实际库容量为4.5×107；经过4轮富集筛淘及ELISA鉴定后获得4株阳性克隆M1、M2、M3、M4；对阳性克隆特异性分析发现，M1、M2、M3、M4表达的噬菌体抗体均与三种肝癌细胞结合，而与正常肝细胞、肠癌细胞、胃癌细胞和胰腺癌细胞不结合。 结论：（1）错配PCR结合DNA改组技术是进行抗体体外亲和力成熟的一种有效且简便的手段；（2）经筛选获得的4株阳性克隆M1、M2、M3、M4与原始克隆A4-16同样具有良好的抗原结合特异性。 第二部分 抗肝癌噬菌体抗体相对亲和力测定和氨基酸序列分析 目的：比较阳性克隆M1、M2、M3、M4与原始克隆A4-16噬菌体抗体的相对亲和力，并且分析阳性克隆中突变的氨基酸序列；将所有发生在CDR区的突变进行组合后获得的新突变体DM的亲和力进行初步评价。 方法：以硫氰酸盐洗脱法测定4株阳性克隆M1、M2、M3、M4和原始克隆A4-16表达的噬菌体抗体相对亲和力；选取高亲和力的阳性克隆进行基因序列测定并确定序
程虹,刘彦仿,张惠中,沈万安,杨安钢,马福成[10]（2003）在《sFv-TNF-α基因修饰的PBMCs对人肝癌细胞系HHCC的体外杀伤活性研究》文中认为目的 观察分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因 （sFv TNF α）的重组逆转录病毒转导的PBMCs对体外培养人肝癌细胞 （HHCC）的杀伤作用。方法 用感染性重组病毒产生细胞C2 2 （PA3 17 PST）产生的病毒上清转导人PBMCs ,采用PCR、RT PCR方法对转导的PBMCs进行DNA和mRNA水平的分析。转导的PBMCs（PBMCs PST）与HHCC共培养 ,MTT法检测PBMCs PST表达产物对肝癌细胞的体外杀伤活性。结果 PCR、RT PCR结果显示PBMCs PST中扩增出外源目的基因对应的电泳条带。MTT法检测结果 ,分泌型抗肝癌单链双功能抗体对体外培养肝癌细胞HHCC的杀伤率为 （ 3 1.4± 4.1） %。结论 分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因可以在PBMCs中整合并稳定表达 ,其分泌的表达产物对HHCC具有一定的体外杀伤作用。
二、抗肝癌单链双功能抗体在Hut-78细胞系中的表达及体外杀伤活性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗肝癌单链双功能抗体在Hut-78细胞系中的表达及体外杀伤活性（论文提纲范文）
（1）抗GPC3×CD3双特异性抗体的构建及其抗肝癌活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词(ABBREVIATION) |
| 第一章 前言 |
| 1 肝细胞癌的流行现状 |
| 2 肝细胞癌治疗方法和治疗指南 |
| 2.1 HCC临床治疗方法 |
| 2.2 巴塞罗那-临床肝癌分期系统 |
| 3 肝癌的治疗靶点的研究 |
| 3.1 分子靶点 |
| 3.2 受体靶点 |
| 3.3 多肽靶点 |
| 4 GPC3的生物学功能 |
| 4.1 GPC3的结构 |
| 4.2 GPC3的功能 |
| 4.3 GPC3在肿瘤组织中的表达情况 |
| 4.4 GPC3用作诊断和治疗的靶点 |
| 5 双特异性抗体的概况 |
| 5.1 双特异性抗体的类型 |
| 5.2 双特异性抗体的作用机制 |
| 5.3 双特异性抗体在临床肿瘤治疗中的应用 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要仪器 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验常用溶液及培养基配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 分子克隆常规操作 |
| 2.2 细胞试验常规操作 |
| 2.3 双特异性抗体的构建、表达和纯化 |
| 2.4 双特异性抗体的生物活性鉴定 |
| 第三章 结果与分析 |
| 1 双特异性抗体的构建、表达和纯化 |
| 1.1 双特异性抗体的示意图 |
| 1.2 双特异性抗体的真核表达质粒的构建 |
| 1.3 双特异性抗体的表达和纯化 |
| 2 抗人GPC3/CD3双特异性抗体的生物学功能验证 |
| 2.1 流式检测双特异性抗体的细胞结合能力 |
| 2.2 双特异性抗体刺激T细胞释放细胞因子 |
| 2.3 双特异性抗体诱导T细胞激活 |
| 2.4 双特异性抗体的体外细胞杀伤效果检测 |
| 2.5 双特异性抗体的动物实验结果 |
| 第四章 讨论 |
| 1 双特异性抗体的设计 |
| 2 双特异性抗体的体外生物活性 |
| 3 双特异性抗体的体内抑瘤效果 |
| 第五章 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）抗B7-H4-scFv/PE38KDEL重组免疫毒素的表达和功能性检测（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 抗B7-H4单链抗体的研究 |
| 1.1 B7-H4分子的简介 |
| 1.2 B7-H4分子的结构及其分布 |
| 1.3 B7-H4分子在相关疾病方面的研究 |
| 1.3.1 B7-H4与肿瘤 |
| 1.3.2 B7-H4与自身免疫疾病 |
| 1.3.3 B7-H4与器官移植 |
| 1.4 单链抗体的简介 |
| 1.5 单链抗体在肿瘤导向治疗中的作用 |
| 1.6 单链抗体与免疫毒素的联系 |
| 1.7 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 重组免疫毒素的研究 |
| 2.1 免疫毒素的概念 |
| 2.2 免疫毒素组成部分的选择和类型 |
| 2.2.1 根据“弹头”的种类划分 |
| 2.2.2 根据“载体”的种类划分 |
| 2.2.3 临床试验的几种免疫毒素 |
| 2.3 免疫毒素的作用机制 |
| 2.4 免疫毒素面临的问题 |
| 2.5 免疫毒素的前景与展望 |
| 2.6 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 PE类重组毒素的研究 |
| 3.1 PE类毒素的概念及分子组成 |
| 3.2 PE类毒素的衍生物 |
| 3.3 PE类毒素的作用机制 |
| 3.4 PE类毒素的应用 |
| 3.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第四章 重组毒素表达载体pET28a-anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL的构建和克隆 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 质粒和菌株 |
| 4.2 实验方法与材料 |
| 4.2.1 PE38KDEL基因的合成 |
| 4.2.2 引物的合成 |
| 4.2.3 单抗anti-B7-H4-scFv基因与毒素PE38KDEL基因的扩增、克隆 |
| 4.2.4 单抗anti-B7-H4-scFv基因与毒素PE38KDEL基因的连接 |
| 4.2.5 感受态细胞的制备 |
| 4.2.6 重组表达载体的构建 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 扩增和克隆anti-B7-H4-scFv基因、PE38KDEL基因和anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL基因的结果 |
| 4.3.2 重组基因的测序结果 |
| 4.3.3 重组表达载体的构建鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 重组免疫毒素Anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL的表达、纯化及活性检测 |
| 5.1 实验材料及试剂 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 细胞系和模式动物 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 重组蛋白Anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL的诱导表达 |
| 5.2.2 目的蛋白的变、复性 |
| 5.2.3 目的蛋白的纯化 |
| 5.2.4 间接ELISA检测目的蛋白与B7-H4抗原的亲和性 |
| 5.2.5 流式细胞术检测重组毒素与不同细胞的结合活性 |
| 5.2.6 数据处理与统计 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 重组毒素蛋白的表达优化 |
| 5.3.2 重组毒素蛋白的表达分析 |
| 5.3.3 重组毒素蛋白的纯化与鉴定 |
| 5.3.4 间接ELISA鉴定重组毒素蛋白和B7-H4抗原蛋白的亲和活性 |
| 5.3.5 流式细胞术检测重组毒素与不同细胞的结合活性 |
| 5.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 重组毒素蛋白Anti-B7-H4-scFv-PE38KDEL体外和体内的生物学功能鉴定 |
| 6.1 实验材料及试剂 |
| 6.1.1 主要试剂 |
| 6.1.2 实验仪器 |
| 6.1.3 细胞系和模式动物 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 细胞培养及形态学观察 |
| 6.2.2 MTT法检测免疫毒素对细胞增殖的影响 |
| 6.2.3 台盼蓝染色检测细胞活力 |
| 6.2.4 细胞培养 |
| 6.2.5 建立皮下移植瘤模型 |
| 6.2.6 肿瘤组织HE染色 |
| 6.2.7 免疫组化分析 |
| 6.2.8 数据处理与统计 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 细胞形态学观察及MTT法检测细胞增殖 |
| 6.3.2 台盼蓝染色结果 |
| 6.3.3 荷瘤鼠体重和瘤体积变化及相对肿瘤增殖率 |
| 6.3.4 瘤重 |
| 6.3.5 瘤组织HE染色结果 |
| 6.3.6 免疫组化分析 |
| 6.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 全文总结 |
| 附一 |
| 攻读硕士期间发表的论文及科研成果 |
| 致谢 |
（3）pVAX1/SjscFv-IL18对日本血吸虫病肝纤维化的影响及其作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第一章 pVAX1/SjscFv-IL18真核质粒的构建、表达、鉴定及提取 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 质粒、菌株 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 引物 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 SOE-PCR扩增SjscFv-IL18基因 |
| 1.2.2 pVAX1/SjscFv-IL18的构建和鉴定 |
| 1.2.3 SjscFv-IL18基因的生物信息学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 pVAX1/SjscFv-IL18对HSCs胶原生成与降解的影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 SEA的制备及浓度测定 |
| 2.2.2 巨噬细胞的分化 |
| 2.2.3 刺激巨噬细胞分泌TGF β1的SEA浓度的确定 |
| 2.2.4 重组质粒DNA转染巨噬细胞 |
| 2.2.5 qPCR检测HSCs中目的基因mRNA的表达 |
| 2.2.6 MTT检测HSCs细胞增殖 |
| 2.2.7 流式细胞仪分析HSCs细胞凋亡率 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 SEA蛋白的浓度测定 |
| 2.3.2 巨噬细胞的分化和最适SEA刺激浓度的确定 |
| 2.3.3 重组质粒转染后能诱导巨噬细胞高表达IFN-γ |
| 2.3.4 真核重组质粒对HSCs活化的影响 |
| 2.3.5 MTT检测HSCs细胞增殖 |
| 2.3.6 流式细胞仪检测HSCs细胞凋亡 |
| 2.3.7 真核重组质粒转染巨噬细胞对HSCs胶原生成的影响 |
| 2.3.8 真核重组质粒对HSCs胶原降解的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 SEA能够直接刺激巨噬细胞分泌TGF β1 |
| 2.4.2 重组质粒对HSCs激活的影响 |
| 2.4.3 重组质粒转染巨噬细胞对HSCs增殖和凋亡的影响 |
| 2.4.4 重组质粒对HSCs中胶原相关基因表达的影响 |
| 第三章 pVAX1/SjscFv-IL18对日本血吸虫病肝纤维化的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物和阳性钉螺 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 引物 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 pVAX1/SjscFv-IL18在小鼠体内的表达 |
| 3.2.2 日本血吸虫病肝纤维化动物模型的建立 |
| 3.2.3 不同时间点注射重组真核质粒 |
| 3.2.4 血清的分离和肝组织匀浆的制备 |
| 3.2.5 血清中Th1/Th2型细胞因子检测 |
| 3.2.6 肝脏组织病理学分析 |
| 3.2.7 qPCR鉴定肝组织中与胶原相关的基因mRNA表达 |
| 3.2.8 ELISA分析IL-18在体内的分布 |
| 3.2.9 免疫组化分析IL-18在肝组织切片中的分布 |
| 3.2.10 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 pVAX1/SjscFv-IL18能在体内诱导IL-18高表达 |
| 3.3.2 pVAX1/SjscFv-IL18对肝纤维化的治疗作用 |
| 3.3.3 pVAX1/SjscFv-IL18能在体内诱导Th1型优势免疫应答 |
| 3.3.4 IHC检测各组小鼠肝脏中的TGFβ1 |
| 3.3.5 qPCR检测肝组织中与胶原相关的基因mRNA表达 |
| 3.3.6 IL-18在日本血吸虫感染鼠的血清和肝匀浆中的差异性分布 |
| 3.3.7 IHC检测IL-18在肉芽肿局部的分布 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 pVAX1/SjscFv-IL18诱导Th1型优势免疫反应 |
| 3.4.2 早期给予pVAX1/SjscFv-IL18治疗具有更好的抗纤维化效果 |
| 3.4.3 pVAX1/SjscFv-IL18降低肝组织中TGF β1蛋白含量 |
| 3.4.4 pVAX1/SjscFv-IL18能调节胶原相关基因的mRNA水平 |
| 3.4.5 pVAX1/SjscFv-IL18的特异性靶向作用 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间主要研究成果 |
（4）抗人CD80单链抗体（ScFv）及双价抗体（diabody）的研制及生物学功能初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一部分 抗人CD80 单链抗体（ScFv）的研制及生物学功能初步研究 |
| 1 材料和试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 第二部分 抗人CD80 双价抗体（diabody）的研制及生物学功能初步研究 |
| 1 材料和试剂 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 全文总结与展望 |
| 本研究所获得的基金资助 |
| 硕士研究生期间发表的论文 |
| 基因工程小片段抗体及其应用 |
| 参考文献 |
| 缩写词表 |
| 致谢 |
（5）131Ⅰ标记抗胃泌素释放肽前体单链抗体scFv的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 NCI-H446、Hela、H460、A549 细胞株的ProGRP 表达检测 |
| 一、主要仪器与材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第二部分 (131)~I 标记anti-ProGRP_((31-98)) scFv 及其在正常昆明小鼠体内分布的研究 |
| 一、主要仪器与材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第三部分 (131)~I-anti-ProGRP_((31-98)) scFv 在小细胞肺癌荷瘤裸鼠模型体内分布及初步放免显像研究 |
| 一、主要仪器与材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 攻读学位期间公开发表的论文及科研成果 |
| 参加学术会议及获奖 |
| 致谢 |
（6）人源性抗FGF-2中和性抗体的筛选，表达及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 噬菌体抗体库的筛选 |
| 第四章 人源性抗FGF-2抗体的原核表达 |
| 第五章 人源性抗FGF-2抗体的真核表达 |
| 第六章 抗体生物学活性的鉴定 |
| 第七章 抗体亲和力成熟 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 英文缩略词表 |
| 博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 研究生毕业论文统计学审稿证明 |
（7）西维因单链抗体基因克隆、表达及活性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 西维因农药残留检测技术简介 |
| 1.1.1 西维因简介 |
| 1.1.2 西维因的应用及残留危害 |
| 1.1.3 西维因残留检测方法 |
| 1.2 单链抗体技术研究进展 |
| 1.2.1 抗体简介 |
| 1.2.2 抗体工程简介 |
| 1.2.3 基因工程抗体分类 |
| 1.2.4 单链抗体(single-chain Fv,scFv) |
| 1.2.5 scFv制备技术分类 |
| 1.2.6 scFv的应用 |
| 1.2.7 单链抗体应用前景展望 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 1.4 研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株及细胞株 |
| 2.1.2 主要试剂、溶液及培养基 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 V_L、V_H克隆及测序鉴定 |
| 2.2.2 scFv基因片段克隆 |
| 2.2.3 重组表达载体构建与诱导表达 |
| 2.2.4 包涵体复性的条件优化 |
| 2.2.5 scFv纯化与活性鉴定 |
| 2.2.6 svFv可溶性表达 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 V_L、V_H克隆及测序鉴定 |
| 3.1.1 从西维因杂交瘤细胞中提取总RNA |
| 3.1.2 轻重链可变区基因扩增 |
| 3.1.3 阳性重组子筛选 |
| 3.1.4 测序结果分析及鉴定 |
| 3.2 scFv基因片段克隆 |
| 3.3 重组表达载体构建及测序验证 |
| 3.4 重组表达 |
| 3.5 复性条件优化 |
| 3.5.1 复性方法的确定 |
| 3.5.2 复性时间的优化 |
| 3.5.3 复性蛋白起始浓度的优化 |
| 3.5.4 复性液组成成分进行的优化 |
| 3.6 复性蛋白纯化及活力测定 |
| 3.6.1 复性蛋白纯化 |
| 3.6.2 直接竞争ELISA验证复性抗体活性 |
| 3.7 scFv的可溶性表达 |
| 3.7.1 scFv-pET26b重组质粒的构建及可溶性表达 |
| 3.7.2 OPH-scFv-pET26b可溶性表达质粒构建及可溶性表达 |
| 4 结论 |
| 5 展望 |
| 6 参考文献 |
| 7 硕士期间发表论文情况 |
| 8 致谢 |
（8）抗黑色素瘤scFv-mTNF-α免疫细胞因子的构建及其抗肿瘤活性研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 单链抗体的研究现况与展望 |
| 2 肿瘤坏死因子-α |
| 第一部分 抗黑色素瘤单链抗体与肿瘤坏死因子基因的鉴定及免疫细胞因子结构预测 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 抗黑色素瘤免疫细胞因子SCFV-TNF 原核表达载体的构建和表达 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 免疫细胞因子SCFV-TNF 体内外抗黑色素瘤活性的初步实验研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（9）抗肝癌单链抗体的体外亲和力成熟研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 抗肝癌噬菌体单链抗体突变库的构建和筛选 |
| 前言 |
| 实验设计与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 抗肝癌噬菌体抗体相对亲和力测定和氨基酸序列分析 |
| 前言 |
| 实验设计与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 抗肝癌可溶性单链抗体的表达和亲和力常数测定 |
| 前言 |
| 实验设计与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 缩写词表 |
| 在校期间发表的论文 |
| 致谢 |
四、抗肝癌单链双功能抗体在Hut-78细胞系中的表达及体外杀伤活性（论文参考文献）
- [1]抗GPC3×CD3双特异性抗体的构建及其抗肝癌活性研究[D]. 胡耀凯. 厦门大学, 2018(07)
- [2]抗B7-H4-scFv/PE38KDEL重组免疫毒素的表达和功能性检测[D]. 纪洪帅. 南京师范大学, 2018(01)
- [3]pVAX1/SjscFv-IL18对日本血吸虫病肝纤维化的影响及其作用机制的研究[D]. 田智. 中南大学, 2012(03)
- [4]抗人CD80单链抗体（ScFv）及双价抗体（diabody）的研制及生物学功能初步研究[D]. 陈昌友. 苏州大学, 2011(06)
- [5]131Ⅰ标记抗胃泌素释放肽前体单链抗体scFv的实验研究[D]. 洪智慧. 苏州大学, 2011(06)
- [6]人源性抗FGF-2中和性抗体的筛选，表达及鉴定[D]. 陶俊. 南方医科大学, 2010(12)
- [7]西维因单链抗体基因克隆、表达及活性分析[D]. 张伟伟. 天津科技大学, 2010(01)
- [8]抗黑色素瘤scFv-mTNF-α免疫细胞因子的构建及其抗肿瘤活性研究[D]. 苏醒. 中国人民解放军军事医学科学院, 2008(11)
- [9]抗肝癌单链抗体的体外亲和力成熟研究[D]. 卢筱华. 暨南大学, 2006(05)
- [10]sFv-TNF-α基因修饰的PBMCs对人肝癌细胞系HHCC的体外杀伤活性研究[J]. 程虹,刘彦仿,张惠中,沈万安,杨安钢,马福成. 第三军医大学学报, 2003(14)