一、丙型肝炎病毒核心蛋白抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定（论文文献综述）
伊春艳[1]（2019）在《呼吸道合胞病毒全人中和抗体制备、表位鉴定及应用研究》文中指出呼吸道合胞病毒（RSV,Respiratory syncytial virus）是最常见的导致婴幼儿急性呼吸道感染的病原体,同时还被公认为是某些高风险成年人（诸如老年人、患有慢性疾病的成年个体以及免疫功能低下人群）的重要病原体。RSV病毒在老年人群中的引起住院和死亡率与流感相当。当前,市面上缺少有效的RSV预防性疫苗,同时也缺少RSV特异性的抗病毒药物来治疗RSV感染。人源化的帕利珠单抗（palivizumab）是唯一被批准用于预防高风险儿童RSV感染的单克隆抗体药物。但是,Palivizumab并不能有效地治疗RSV感染而且体内外实验已经证明逃逸突变体的存在。因此,开发新的全人抗体替代药物是RSV研究的热点。RSV病毒属于副粘病毒科有包膜病毒,基因组为单股负链非节段RNA,分为有A和B两种亚型。融合蛋白（F,fusion protein）和吸附蛋白（G,attachment glycoprotein）是RSV病毒表面上两种主要的糖蛋白,在介导病毒进入细胞的过程中发挥着重要的角色。F蛋白和G蛋白刺激机体产生保护性免疫应答,是中和抗体的主要靶标,也是疫苗设计和小分抑制剂的重要靶点。我们的主要发现如下:第一,中和抗体在预防RSV的感染中发挥重要的保护作用,但是对RSV自然感染的过程中人的抗体应答了解是有限的,尤其是对G蛋白的抗体研究报道更少。为了能更好地了解RSV自然感染过程中F蛋白和G蛋白的抗体免疫应答情况以及开发新的抗体分子作为被动免疫的潜在药物,我们对31例健康的成年人的血清进行了分析,包括中和抗体滴度,以及结合F蛋白融合前形式（pre-F）,G蛋白以及两种亚型的G蛋白保守中央结构域（CCD,central conserved domain）的ELISA抗体滴度。我们用统计学的方法初步了进行相关性的分析,揭示血清中和抗体的滴度与F蛋白滴度没有直接关联,可能与靶向某一些抗原位点的中和抗体关联更大。此外我们证实针对G蛋白CCD结构域的广谱交叉活性的抗体在血清中普遍存在。第二,我们用单细胞PCR技术从其中一名中和抗体滴度最高的志愿者的外周血记忆B细胞中分离了30株针对pre-F蛋白和G蛋白的抗体。通过对F蛋白抗体进行体外结合活性,微中和活性和表位鉴定,我们的结果显示抗F蛋白的中和抗体主要靶向抗原位点φ和抗原位点III为主的四元表位,暗示这名志愿者的血清中和活性可能与存在这两个表位的抗体有关。第三,为了了解分离的F蛋白中和抗体是如何进化的以及是否具有一些相似的遗传特征,我们对四株中和活性最高的抗体的重轻链可变区的胚系来源,体细胞高频突变频率,高可变区（CDR）长度,CDR3的长度进行了分析和比较。研究结果提示B细胞倾向使用IGHV3-21*01和IGLV1-40*1的组合靶向RSV F蛋白上比较保守的敏感抗原位点III,这些抗体可能拥有一些共同的分子结构特征识别一个相似的表位,同时我们证实靶向这个表位的3F4抗体交叉结合呼吸道合胞病毒和人偏肺病毒（hMPV,human metapneumovirus）的F蛋白。第四,我们体内外比较了4E6,4F1和palivizumab的保护活性。微中和实验的结果显示4E6和4F1抗体对RSV A型和B型的中和能力均优于palivizumab,尤其是4F1效果更突出,IC50比palivizumab低近80-100倍。小鼠的预防实验结果显示:4F1和4E6抗能有效地抑制肺部RSV病毒的含量,且抑制效果优于palivizumab。小鼠的肺组织病理切片结果显示:相比palivizumab,4F1高剂量和低剂量组能明显的抑制早起感染单核细胞向小鼠支气管,肺间质和肺泡间隙的浸润。以上结果提示4F1具有很大开发成药物用于预防RSV感染的潜力。此外,我们证实了靶向两个不同表位的抗体4F1和4E6联合使用在抗病毒效果上具有协同作用,同时基于这一结果,我们制备了双特异性抗体,结合实验和微中和实验均证明了双特异性抗体比单个抗体或联合中和效果更明显,同时具有更好的广谱性。综上所述,通过对数十名健康志愿者的血清进行分析,我们发现在健康的成年人体内,除了存在抗F蛋白抗体外,也普遍存在抗G蛋白保守结构域的抗体,这些抗体在抗RSV感染中发挥的功能以及机制值得我们进一步深入探究;本研究新发现的抗体分子是RSV被动免疫的潜在药物;而本研究中获得的一系列抗体的表位解析及抗体进化研究为基于pre-F蛋白疫苗候选者需保留的抗原位点提供了强而有力的支撑;我们首次报道了靶向F蛋白上两个不同表位的抗体联合使用具有协同作用,我们设计的双特异性抗体为预防RSV严重感染的被动免疫疗法提出了新的思路。
杜晓明[2]（2012）在《人源性TRAb Fab段抗体库的构建筛选与鉴定》文中研究指明背景和目的Graves病患者血清中的促甲状腺素受体抗体（TRAb）分为:（1）TSH受体刺激性抗体（TSAb）;（2）TSH受体刺激阻断性抗体（TSBAb）;（3）中性TSH受体抗体。随着基因工程技术的发展,运用噬菌体展示技术,通过对人源性促甲状腺素抗体Fab片段抗体库的构建筛选、鉴定,得到TRAb单克隆抗体,为进一步建立TRAb的定量分析方法及探索免疫干预治疗奠定基础。方法（1）从血清TRAb浓度大于40IU/L的自身免疫性甲状腺疾病患者外周血中,抽提总RNA,反转录获取cDNA。以获取的cDNA为模版,PCR法扩增免疫球蛋白分子轻链λ、λ基因及重链Fd基因。将轻链克隆入pComb3Hss载体以构建轻链文库。将重链基因载入κ/λ-pComb3Hss载体,构建完成组合文库。（2）将重组质粒转化大肠杆菌XL1-Blue,用辅助噬菌体M13K07感染,随机的组合文库表达于丝状噬菌体表面,完成噬菌体表面展示。（3）应用固相化抗原（TSHR-N）吸附筛选法通过数轮"吸附—洗脱—扩增"富集噬菌体抗体,筛选阳性克隆。（4）取阳性克隆的噬菌体DNA,切除gⅢ基因片段,自连接后转化大肠杆菌XL1-B1ue,以IPTG诱导表达可溶性TRAb Fab片段,应用间接ELISA法对表达产物进行鉴定。（5）利用亲和层析柱纯化人源性TRAb Fab片段,Western blotting鉴定纯化产物。（6）对表达较好的阳性克隆进行测序分析,轻链和重链可变区的DNA序列采用双向测序。结果（1）从外周血单个核细胞中抽提得到总RNA,并成功反转录获得cDNA文库。（2）PCR法扩增了大小均为680bp左右的轻链κ、λ基因及重链Fd基因,并成功构建了库容为1.32 × 105基因抗体库（轻链库）和库容为2.28 × 1 05Fab抗体库（组合文库）。（3）通过噬菌体表面展示技术,在辅助噬菌体M13K07的帮助下,在组合文库的基础上获得了富含TRAb Fab片段的人源性噬菌体抗体库。（4）以TSHR-N为抗原,通过固相化抗原吸附筛选法对构建的Fab噬菌体抗体库进行5轮富集筛选,初步成功筛选到特异性TRAb Fab噬菌体抗体,富集效应约77倍。（5）通过Phage-ELISA检测,结果鉴定出了具有抗原结合活性的单克隆。提取阳性克隆的噬菌体DNA,切除gⅢ基因片段,实现了可溶性人源性TRAb Fab片段的表达。（6）利用Ni2+金属敖合层析法获得纯化的人源性TRAb Fab片段。（7）间接ELISA法检测结果显示:制备的可溶性人源性TRAb Fab片段具有特异性结合TSHR-N端的免疫学活性。（8）经GenBank检索DNA序列分析,证实该克隆的轻链可变区与人的免疫球蛋白λ链同源性达到94.4%,重链可变区与人的免疫球蛋白IgG重链VH4同源性为88.9%。结论本研究通过噬菌体展示技术成功构建了人源性TRAb Fab片段组合文库,并通过固相化抗原吸附筛选法筛选获得阳性克隆,实现了可溶性TRAb Fab片段的表达,基因测序证实其轻重链与人免疫球蛋白可变区具有同源性,ELISA结果显示其具有特异性结合TSHR-N端的免疫学活性。
郭莉[3]（2006）在《一个新的白细胞膜抗原ZCH-2B8a编码基因及其生物学特性的研究》文中进行了进一步梳理血液系统恶性肿瘤是当今医学上的顽症之一,细胞膜表面分化抗原（CD）分子的研究能提高对其生物学行为的认识,有利于诊断治疗。通过单克隆抗体（单抗）进而研究细胞膜抗原生物学特性是蛋白质功能研究的重要方法。ZCH（Zhejiang Childrens Hospital）-288a（简称ZCH-288a）是本科研究室自行研制的鼠抗人造血细胞分化抗原的单抗,已经提交第8届国际人类白细胞分化抗原协作组会议（HLDA8）鉴定,根据HLDA8总部经大量研究的反馈信息表明:该抗体识别的抗原性质不明,属国际上尚未认识的血细胞膜新的分化抗原（新的CD分子）。因此,对其识别抗原编码基因克隆与测序及其生物学功能研究有着重要的科学意义和潜在的应用前景。 1 直标鼠抗人新单抗ZCH-288a-FITC的研制及鉴定 为了深入研究ZCH-2B8a抗体识别抗原的表达谱及生物学功能,有利于利用流式细胞仪作多色分析和抗原阻滞试验,减少实验误差,拟将该抗体研制成异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate,FITC）直接标记的抗体2B8a-FITC。在清洁级BALB/c小鼠腹腔内注射1×106能分泌2BSa单抗（2B8aAb）的杂交瘤细胞,制备大量2B8aAb腹水。通过Econo-Pac蛋白A柱进行亲和层析,纯化2B8aAb,纯化后的2B8aAb经SDS-PAGE凝胶电泳检测,纯度高,达99%以上。采用改良Marsshall法,用FITC标记纯化的2B8aAb,多余FITC经PBS充分透析除去,用紫外分光光度计测定A495/A280比值为0.56,介于FITC荧光抗体的理想比值0.3～1.0之间。流式细胞术检测显示,直标单抗2B8a-FITC与间接标记法2B8a+GAM-FITC在Raji细胞上的反应峰型相似,虽然前者的平均荧光强度指数（MFI,98.61）略低于后者（106.89）,但阳性反应率基本一致,分别为99.11%和99.00%,表明直标荧光抗体2B8a-FITC制备成功。
钟彦伟,吴顺华,成军,徐东平,戴久增,高学松,曲建慧,王巧侠,李晓东,郭风劲,郭江,纪冬[4]（2006）在《应用噬菌体展示技术筛选干扰素β基因启动子DNA结合蛋白的基因》文中研究指明目的筛选干扰素β（IFN-β）启动子DNA结合蛋白的基因,探讨IFN-β基因调节的分子生物学机制。方法应用噬菌体展示技术,以IFN-β启动子DNA的聚合酶链反应（PCR）产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的生物筛选过程,噬斑PCR扩增后,对所筛选克隆进行DNA序列测定和生物信息学分析。结果噬菌体经富集后,随机挑选52个克隆,序列测定后经过同源性搜索,确定与IFN-β启动子具有结合作用的肝细胞蛋白有6种,包括谷胱甘肽S-转移酶（GST）,淀粉酶突变体蛋白,锌指蛋白等与细胞发育和代谢有关的蛋白。结论IFN-β启动子DNA与肝细胞中多种蛋白类型结合,为研究IFN-β基因在肝细胞中的表达调控奠定了基础。
陈丽珊[5]（2005）在《丙型肝炎病毒多表位抗原基因pcx3的构建、表达及免疫原性研究》文中指出丙型肝炎病毒（HCV）为单股正链RNA病毒，其基因组编码约3010～3033aa的蛋白前体，从N-端起依次为核心蛋白（C）、包膜蛋白（E）、非结构蛋白NS1-NS5B。HCV具有高度的变异性，能够迅速突变逃逸宿主的免疫系统。因此，给疫苗的研究带来许多的困难。近年来的研究提示理想的HCV疫苗必须能够诱发高水平、广谱而特异的体液免疫应答和细胞免疫应答。 针对HCV的高度变异性及免疫特点，在HCV基因产物中优选了5个具有良好免疫原性的高度保守B／T细胞表位，组合成一个多表位抗原基因pcx，这些表位分别来自核心蛋白（1～16aa，132～141aa），E1（126～135aa），NS3（139～147aa）及NS5B（768～775aa），以及破伤风毒素的T细胞表位用以增强T细胞免疫。前期的研究表明与β-半乳糖苷酶融合表达的多表位抗原PCX具有良好的HCV免疫特异性。 pcx基因经过串联重复之后，构建成多表位抗原基因pcx3，与6×His-tag融合后，在E.coli宿主中获得高效表达。利用C端融合的6×His-tag经过Ni2+-NTA-agarose亲和层析柱纯化后，得到高纯度的目的蛋白。利用BCA法对蛋白质进行定量。 Western blot结果显示原核或真核表达的PCX3抗原均能被HCV患者阳性血清所识别，表明多表位抗原具有能被HCV抗体特异性识别的表位。ELISA结果显示来自不同地区的不同患者血清中抗-HCV抗体能与PCX3抗原特异反应，62份阳性血清中PCX3抗原检测的检出率为83.8％，提示PCX3抗原的B细胞表位能被HCV抗体广泛识别。而PCX抗原的检出率为70％，表明经过串联重复后的抗原与HCV抗体的反应更强，显示出良好的免疫原性。 纯化的PCX3蛋白与完全弗氏佐剂一起免疫BALB／c小鼠后，能够诱发高滴度的特异性IgG（1×106），并持续保持数月。不同剂量组进行比较，发现50μg的剂量能够诱发理想的体液免疫反应。另外，利用PCX免疫小鼠的特异性抗体滴度最高达1×104，这一结果表明，与PCX抗原相比，串联重复的PCX3抗原能够诱发更强的免疫反应。抗PCX3抗血清与多肽的反应显示位于核心蛋白的P1（MTSTNPKPQRKTKRNTN）以及NS3蛋白的P6（TGDFDSVID）这两个B细胞表位与抗体反应的滴度较高，提示二者在诱导HCV特异的体液免疫反应中发挥主要作用。 PCX3蛋白可诱发较高水平的特异性CTL效应，特异性杀伤率为39.2％。在多肽表位中，NS5B的T细胞表位（ELITSCSS）的溶解率最高，提示该表位在诱发CTL杀伤效应中具有重要的作用。流式细胞仪检测外周血淋巴细胞表明，HCV多表位抗原PCX3免疫小鼠6周后，CD3+CD4+T细胞比例明显升高，说明该蛋白可以有效刺激CD3+CD4+Th细胞增殖。针对免疫小鼠的安全性评价表明这一多表位抗原免疫是安全而有效的。 利用实时荧光定量PCR技术检测PCX3抗血清体外与病毒粒子（genotype 2a）的结合，实验结果表明孵育过夜后，PCX3抗血清在体外能够结合绝大部分的病毒粒子，初步显示PCX3抗血清具有抗病毒感染的可能，为进一步抑制病毒感染的试验提供基础。 本实验中用于检验体液免疫被动保护反应的模型是SCID／Alb-uPA转基因小鼠。这种SCID／Alb-uPA纯合的小鼠体内进行人体肝细胞移植后，建立具有嵌合的人肝组织的转基因小鼠。利用HCV阳性血清进行腹膜内注射感染，病毒不仅能够复制，而且产生了具有感染性的颗粒，可以作为HCV感染的小鼠模型。利用该模型的研究表明HCV阳性血清（HCV genotype la，3.0E+6 IU／ml）与PCX3诱导的高滴度抗血清孵育过夜后进行感染，两周后检测发现实验组中有两只小鼠血清中含有低于500U的RNA拷贝数，其它三只血清中的RNA则为阴性，而对照组的7只小鼠全部感染了HCV，血清中的RNA拷贝数为3.0E+03到3.5E+06 IU／ml。这一结果表明PCX3诱导的抗血清能使2／5的小鼠病毒滴度显着减少，并且保护3／5的小鼠避免HCV感染，在被动免疫保护反应方面发挥重要的作用。 对PCX3抗血清进行分析，发现它能与HCV的核心蛋白、NS3蛋白特异性结合，验证了抗血清中含有抗核心蛋白与NS3蛋白的抗体。利用PCX3抗原制备的单克隆抗体中筛选到两株分别与HCV核心蛋白以及NS3蛋白结合，一株与包膜蛋白E1的表位多肽P5（RMAWDMMMW）反应的单抗。表明PCX3诱导的体液免疫反应中包含这三个蛋白的B细胞表位（P1，P5和P6）所引起的免疫反应，且这些单抗可用于进一步研究抗体与病毒粒子的结合。在此基础上，选取抗核心蛋白的杂交瘤细胞株进行抗体的基因克隆，以期获得具有应用价值的单链抗体，结果筛选到表达特定条带的阳性克隆株，并经过测序鉴定。为抗体的应用研究奠定基础。 综上所述，我们的结果表明，本研究所构建的多表位抗原PCX3可以诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫应答，产生的抗体不仅能在体外结合基因型2a的HCV病毒粒子，且更重要的是，在小鼠的感染模型中抑制了基因型1a的HCV感染，因此，这一抗原有望成为广泛而有效的HCV疫苗候选者。
成军[6]（2004）在《功能基因组学与肝脏疾病研究》文中研究说明功能基因组学是指应用整体的研究技术阐明基因和蛋白的生物学功能.因此,需要发展一些强大的分析技术,对基因和蛋白质的功能进行研究.这必将为肝脏病学的研究提供了一个前所未有的发展机遇.本文主要论述功能基因组学的先进技术在肝病领域的应用.
钟彦伟,成军,张忠东,李强,李莉,陈菊梅[7]（2004）在《丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达》文中提出目的 在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体。方法 采用噬菌体表面展示技术 ,将丙型肝炎病毒 （HCV）核心蛋白单克隆抗体固相包被于Nunc板。从人源噬菌体单链可变区抗体库中经过 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选 ,获得结合活性较强的人源HCV核心蛋白抗独特型 （抗 Id）scFv阳性克隆。从阳性克隆中提取质粒 ,经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后 ,亚克隆到pCANTAB5E载体 ,转化大肠杆菌XL1 Blue ,应用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 （IPTG）诱导表达可溶性的HCV核心蛋白抗独特型单链可变区抗体。酶联免疫吸附法 （ELISA）证实表达的HCV核心蛋白抗 IdscFv具有与HCV核心蛋白单克隆抗体反应的特异性。对转化的大肠杆菌XL1 Blue上清中表达的HCV核心蛋白抗 IdscFv进行硫酸铵沉淀 ,并进行SDS PAGE电泳。结果 筛选得到的HCV核心蛋白抗 IdscFv片段基因由 774bp组成。SDS PAGE电泳表明 ,大肠杆菌XL1 Blue中表达的可溶性HCV核心蛋白抗 IdscFv分子量约 2 8kD。结论 HCV核心蛋白抗 IdscFv与HCV核心蛋白抗 IdscFv单克隆抗体具有较强的结合活性和特异性。HCV核心蛋白抗 IdscFv的筛选和表达成功 ,为今后HCV核心蛋白抗 IdscFv的研究和应用奠定了基础。
成军[8]（2004）在《噬菌体表面展示技术的新发展及在病毒性肝炎研究中的应用》文中进行了进一步梳理噬菌体展示技术是一种目的基因在噬菌体表面的表达产物与亲和选择相结合的技术。噬菌体结构蛋白pⅢ和pⅧ均可作为载体来展示外源多肽或蛋白质。初期阶段 ,噬菌体展示技术主要是用于单链可变区抗体、随机多肽库等的筛选 ,但近年来随着噬菌体cDNA表达型文库的构建 ,噬菌体展示技术的用途逐渐扩大。目前噬菌体展示技术不仅可以用于研究蛋白结合蛋白 ,而且还可以用来研究DNA/RNA结合蛋白 ,以及非蛋白小分子物质的结合蛋白等。因为蛋白 蛋白之间的结合是许多生物学效应的基础 ,因而噬菌体展示技术的应用范围进一步得到拓展。噬菌体展示技术在研究自身抗体结合与识别的自身抗原、信号转导过程中蛋白之间的相互作用以及肝炎病毒基因表达调节方面都有十分重要的应用前景。
成军[9]（2003）在《病毒性肝炎发病机制相关基因克隆化的研究策略》文中进行了进一步梳理乙型肝炎病毒 （HBV）和丙型肝炎病毒 （HCV）感染引起病毒性肝炎的发病机制目前还有许多方面没有研究清楚。以肝炎病毒相关的新基因克隆化为主要目的的研究是病毒性肝炎发病机制研究领域中创新知识的重要源泉。病毒基因的复制和表达受到肝细胞中蛋白质因子的调节 ,肝炎病毒基因编码的蛋白与肝细胞中的蛋白能够结合 ,这种相互作用对于肝细胞正常的信号转导过程产生显着影响 ,肝炎病毒蛋白在肝细胞中的表达对于肝细胞的基因表达谱产生影响 ,也可能是病毒性肝炎、肝细胞癌 （HCC）发病机制中的主要机制。酵母单杂交技术、酵母双杂交技术、基因芯片技术、抑制性消减杂交技术、噬菌体展示技术、蛋白质分离纯化与基因克隆化的反向遗传学技术等 ,在肝炎病毒基因调控、肝炎病毒蛋白结合蛋白的研究、肝炎病毒蛋白反式激活靶基因的研究中都有重要的应用 ,是促进慢性病毒性肝炎发病机制研究、探索病毒性肝炎新型治疗技术和治疗方法的有效途径和手段。
钟彦伟,成军,张忠东,孙敏,李强,李克,王琳,李莉,张玲霞,陈菊梅[10]（2003）在《噬菌体表面展示技术筛选HCBP6人源单链可变区抗体》文中认为目的:制备丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的肝细胞结合蛋白6（HCBP6）的特异性人源化单链可变区抗体（scFv）。方法:采用噬菌体表面展示技术,将生物合成的应用酵母双杂交技术筛选得到的HCV核心蛋白的肝细胞结合蛋白6（HCBP6）16肽固相包被于Nunc板,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“黏附-洗脱-扩增”筛选过程,随机挑选出48个克隆,利用酶联免疫黏附法（ELISA）、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测,获得与HCBP6结合活性较强的单链可变区抗体片段的阳性克隆,并对HCBP6特异性scFv的编码序列进行序列测定分析。结果:对噬菌体单链可变区抗体库经过5轮“黏附-洗脱-扩增”的筛选后,结合到包被平皿的噬菌体与第一轮相比,富集了162倍。用酶联免疫黏附法测定第5轮筛选后上清液中含有的噬菌体抗体与HCBP6结合活性。其中有30株克隆ELISA的吸光度（A450 nm）值较高（P8 nm 0.77,P240.714,P26 0.728,P29 0.723,P38 0.803,P39 0.762,P43 0.747等）。对这些噬菌体抗体进行与牛血清白蛋白（BSA）的交叉反应后,确定其中有7株交叉反应较弱（P80.145,P24 0.119,P26 0.17,P29 0.186,P38 0.118,P39 0.138,P43 0.178）,结合2次ELISA重复实验的/4值及竞争抑制实验结果,最后确定1株（P24）阳性克隆。提取质粒,SfiI/NotI双酶切后,将片段亚克隆到pCANTABSE载体,进行DNA序列测定,DNA大小为771 bp,符合人源化单链可变区抗体典型的骨架区（FR）及互补决定区（CDR）的序列结构。结论:用噬菌体抗体库技术能够成功地获得HCBP6的scFv。
二、丙型肝炎病毒核心蛋白抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、丙型肝炎病毒核心蛋白抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定（论文提纲范文）
（1）呼吸道合胞病毒全人中和抗体制备、表位鉴定及应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 RSV流行病学介绍 |
| 1.2 RSV分子生物学 |
| 1.2.1 RSV病毒 |
| 1.2.2 G蛋白结构及功能 |
| 1.2.3 F蛋白结构和功能 |
| 1.3 RSV预防和治疗进展 |
| 1.3.1 靶向F蛋白的抗体和小分子抑制剂研究进展 |
| 1.3.2 靶向G蛋白的抗体研究进展 |
| 1.3.3 疫苗研究现状 |
| 1.4 科学问题 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 人样本 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 病毒、载体、菌种和细胞 |
| 2.1.4 基因和引物 |
| 2.1.5 抗体及蛋白 |
| 2.1.6 试剂耗材 |
| 2.1.7 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 ExpiCHO-S瞬时转染表达抗体和F蛋白 |
| 2.2.2 Protein G进行抗体纯化 |
| 2.2.3 RSV F蛋白表达和纯化 |
| 2.2.4 血清抗体滴度和中和活性评价 |
| 2.2.5 血清中和抗体滴度测定 |
| 2.2.6 蛋白生物素标记 |
| 2.2.7 HRP偶联抗体 |
| 2.2.8 抗原特异性记忆B细胞分选,抗体基因扩增及载体构建 |
| 2.2.9 双抗夹心滴定细胞上清抗体浓度 |
| 2.2.10 抗原特异性检测 |
| 2.2.11 竞争ELISA方法检测抗体表位 |
| 2.2.12 丙氨酸定点突变 |
| 2.2.13 脂质体转染 |
| 2.2.14 ELISA验证滴定F突变体浓度及活性 |
| 2.2.15 RSV病毒扩增 |
| 2.2.16 TCID50测定 |
| 2.2.17 空斑免疫染色 |
| 2.2.18 微中和实验 |
| 2.2.19 小鼠动物预防效果检测 |
| 2.2.20 肺组织RNA提取,反转录和Real time PCR |
| 2.2.21 石蜡切片与HE染色 |
| 2.2.22 抗体抑制病毒传播检测 |
| 2.2.23 抗体协同作用分析 |
| 2.2.24 双特性抗体制备 |
| 2.2.25 统计分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 志愿者血清评价 |
| 3.1.1 志愿者血清中和抗体滴度和结合抗体滴度 |
| 3.1.2 血清RSV中和抗体滴度与pre-F抗体滴度和G蛋白抗体滴度相关性分析 |
| 3.1.3 血清中G蛋白抗体滴度与G蛋白中央结构域抗体滴度相关性分析 |
| 3.1.4 小结 |
| 3.2 RSV pre-F蛋白和G蛋白单克隆抗体制备 |
| 3.2.1 利用单细胞PCR的方法从记忆B细胞中分离pre-F和 G蛋白单克隆抗体 |
| 3.2.2 单克隆体外结合活性和微中和活性表征 |
| 3.2.3 小结 |
| 3.3 靶向RSV F蛋白中和抗体功能和机制研究 |
| 3.3.1 靶向F蛋白抗体广谱结合活性分析 |
| 3.3.2 RSV F蛋白中和抗体靶向两个不同的抗原表位 |
| 3.3.3 F抗体序列谱系分析 |
| 3.3.4 与HMPV病毒F蛋白交叉结合验证及影响因素 |
| 3.3.5 小结 |
| 3.4 4E6和4F1 抗体体内外评价及应用研究 |
| 3.4.1 4E6和4F1对RSV A和B型毒株具有广谱微中和活性且优于帕利珠单抗 |
| 3.4.2 4E6和4F1体外抑制RSV病毒的感染和传播 |
| 3.4.3 4E6和4F1 预防RSV对小鼠的感染 |
| 3.4.4 4E6和4F1 联合抗病毒具有协同作用 |
| 3.4.5 双特异性抗体制备及表征 |
| 3.4.6 双特异抗体广谱性 |
| 3.4.7 小结 |
| 3.5 靶向RSV G蛋白抗体广谱结合活性和表位探究 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 RSV自然感染过程中抗体应答情况 |
| 4.2 单个B细胞克隆技术分析RSV F蛋白和G蛋白的免疫应答 |
| 4.3 交叉反应抗体与RSV中和抗体的遗传特征 |
| 4.4 新发现的抗体分子是RSV被动免疫的潜在药物 |
| 4.5 靶向F蛋白两个不同表位的抗体在抗RSV感染中具有协同作用 |
| 4.6 双特异抗体具有独特的抗RSV感染的能力 |
| 4.7 G蛋白中央保守结构域抗体的发现及展望 |
| 第5章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
| 专业综述 |
| 参考文献 |
（2）人源性TRAb Fab段抗体库的构建筛选与鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 技术流程图 |
| 第一部分 人源性促甲状腺素受体抗体Fab片段噬菌体抗体库的构建 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 PCR引物 |
| 1.1.3 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 外周血总RNA提取 |
| 1.2.2 轻、重链基因PCR扩增 |
| 1.2.3 噬粒pComb3Hss的扩增 |
| 1.2.4 轻链库的构建 |
| 1.2.5 噬菌体Fab抗体库的构建和鉴定 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 单克隆抗体的发展 |
| 1.3.2 噬菌体抗体库成功构建的必要条件 |
| 1.3.3 辅助噬菌体作用机理以及扩增 |
| 1.3.4 噬菌体抗体库的机遇和挑战 |
| 1.4 小结 |
| 第二部分 人源性TRAb Fab片段的筛选及初步鉴定 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 TRAb Fab噬菌体抗体的筛选结果 |
| 2.2.2 Phage-ELISA检测噬菌体抗体 |
| 2.2.3 TRAb阳性克隆的鉴定 |
| 2.2.4 TRAb Fab片段的获取 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 用于筛选的抗原 |
| 2.3.2 噬菌体抗体库的筛选技术的原理及影响因素 |
| 2.3.3 人源性TRAb Fab噬菌体抗体的筛选 |
| 2.4 小结 |
| 第三部分 人源性TRAb Fab片段的初步纯化及鉴定 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 可溶性TRAb Fab ELISA鉴定 |
| 3.2.2 SDS-PAGE电泳结果 |
| 3.2.3 免疫学活性鉴定:Western-Blotting |
| 3.2.4 采用CBG定量法对可溶性TRAbFab的表达蛋白定量 |
| 3.2.5 抗体重链和轻链可变区DNA序列的测序分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点及展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述 促甲状腺素受体及其抗体 |
| 综述 噬菌体抗体库 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）一个新的白细胞膜抗原ZCH-2B8a编码基因及其生物学特性的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 直标鼠抗人新单抗ZCH-2BSa-FITC的研制及鉴定 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ZCH-288a单抗及其识别抗原的生物学特性 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 ZCH-288a抗原编码基因克隆和测序 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结、创新点 |
| 综述 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）应用噬菌体展示技术筛选干扰素β基因启动子DNA结合蛋白的基因（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 IFN-β启动子DNA的扩增 |
| 1.3 T7噬菌体文库扩增 |
| 1.4 生物筛选 |
| 1.5 噬斑的PCR扩增 |
| 1.6 序列测定及同源性搜索 |
| 2 结果 |
| 2.1 IFN-β启动子DNA片段的PCR扩增 |
| 2.2 肝细胞cDNA文库的筛选 |
| 2.3 目的基因的PCR扩增 |
| 2.4 序列比对和同源性分析 |
| 3 讨论 |
（5）丙型肝炎病毒多表位抗原基因pcx3的构建、表达及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 前言 |
| 一、丙型肝炎病毒的基因组结构及功能 |
| (一)HCV蛋白的翻译、加工及其功能 |
| (二)HCV复制 |
| (三)病毒颗粒的生活周期 |
| 二、HCv逃避宿主细胞内的防御机制 |
| (一)、宿主抗感染的反应 |
| (二)、控制和逃避宿主反应 |
| 1.利用病毒蛋白控制和逃避宿主反应 |
| 2.病毒突变与宿主反应 |
| 三、HCV的治疗 |
| (一)、干扰素基础上的治疗 |
| (二)、以分子为基础的治疗策略 |
| 1.HCV蛋白酶抑制剂 |
| 2.反义核昔酸 |
| 3.RNA干扰技术 |
| 4.核酶 |
| 5.分子治疗载体 |
| 四、丙型肝炎疫苗 |
| 五、HCV动物模型 |
| (一)、黑猩猩 |
| (二)、转基因小鼠 |
| (三)、携带人肝组织的转基因小鼠 |
| 六、展望 |
| 参考文献: |
| 第二部分 HCV多表位抗原基因pcx3的构建、表达和纯化 |
| 一、材料 |
| 二、试剂 |
| 三、方法 |
| 1 抽提质粒 |
| 2 pxc3基因的克隆以及重组表达载体的构建 |
| 3 目的基因的原核表达 |
| 4 目的基因的真核表达 |
| 5 目的蛋白的纯化及定量 |
| 6 蛋白质的复性 |
| 7 利用BCA法进行蛋白质定量:根据BCA蛋白质定量检测试剂(SK3021)操 作方法: |
| 8 EILSA检测多表位抗原与患者抗-HCV血清反应的特异性 |
| 9 Western blot检测多表位蛋白与抗-HCV抗体反应的特异性 |
| 四、结果 |
| 1 多表位抗原基因pcx3的表位组成及克隆 |
| 2 多表位抗原基因cPx3和pxc的表达与纯化 |
| 3 蛋白质浓度的测定 |
| 4 PCX3蛋白抗-HCV抗体反应的特异性 |
| 五、讨论 |
| 第三部分 HCV多表位基因工程抗原PCX3在小鼠体内免疫应答的研究 |
| 一、材料 |
| 1 试剂 |
| 2 多肤 |
| 3 动物 |
| 二、方法 |
| 1 免疫 |
| 2 特异性抗体的检测 |
| 3 细胞免疫的检测 |
| 4 安全性评价 |
| 5 统计学处理 |
| 三、结果 |
| 1 多表位抗原诱导的特异性体液免疫应答 |
| 2 CTL反应 |
| 3 淋巴细胞亚群分析 |
| 4 安全性评价 |
| 四、讨论 |
| 第四部分 HCV多表位抗原PCX3抗血清体外中和病毒的研究以及单克隆抗体的制备 |
| 一、材料 |
| 二、试剂 |
| 三、方法 |
| 1.Western blot |
| 2.抗血清体外结合病毒试验 |
| 3.抗血清抑制转基因小鼠体内HCV感染的实验 |
| 4.单克隆抗体的制备 |
| 四、结果 |
| 1.PCX3诱导的抗血清体外结合病毒粒子 |
| 2.PCX3诱导的抗血清能够在转基因小鼠模型中抑制HCV的感染 |
| 3.抗血清与HCV蛋白的特异性结合 |
| 4.抗HCV核心蛋白、包膜蛋白、NS3蛋白单克隆抗体的制备 |
| 五、讨论 |
| 第五部分 丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体基因的克隆及表达 |
| 一、材料 |
| 1 细胞株、菌株与质粒 |
| 2 试剂 |
| 3 仪器 |
| 二、方法 |
| (一)单克隆抗体可变区基因的克隆 |
| 1 小鼠杂交瘤细胞中抽提总RNA |
| 2 mRNA逆转录成cDNA |
| 3 扩增轻链、重链可变区cDNA |
| 4 PCR片段的纯化 |
| 5 连接pMD18-T载体 |
| 6 转化大肠杆菌DH5α |
| 7 转化子的筛选及测序 |
| (二)scFv的构建 |
| 1 设计引物并利用PCR连接重链与轻链可变区 |
| 2 PCR片段与pMD18-T载体的连接、转化及鉴定 |
| 3 连接pET19b+表达载体 |
| 4 选取阳性克隆进行小量表达 |
| 三、结果 |
| 1 重链与轻链可变区的基因克隆 |
| 2 重链与轻链可变区序列的测序 |
| 3 单链抗体基因的构建和表达 |
| 4 预测单链抗体的立体模型 |
| 四、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 缩写词中英文对照表 |
| 致谢 |
| 博士生期间获奖与发表论文目录 |
（6）功能基因组学与肝脏疾病研究（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 功能基因组学的定义和内涵 |
| 2 启动子DNA结合蛋白的研究 |
| 3 蛋白与蛋白分子之间的结合 |
| 4 差异显示研究技术 |
| 5 功能缺失表型分析策略 |
| 6 生物信息学技术 |
（8）噬菌体表面展示技术的新发展及在病毒性肝炎研究中的应用（论文提纲范文）
| 1 噬菌体展示技术与基因工程抗体、抗独特型抗体研究 |
| 2 噬菌体展示技术与模拟表位、拮抗多肽研究 |
| 3 噬菌体展示技术与DNA、RNA结合蛋白研究 |
| 4 噬菌体展示技术与蛋白结合蛋白研究 |
| 5 非蛋白小分子结合蛋白筛选 |
（9）病毒性肝炎发病机制相关基因克隆化的研究策略（论文提纲范文）
| 1 肝炎病毒DNA/RNA结合蛋白基因的克隆化 |
| 2 肝炎病毒蛋白结合蛋白基因的克隆化 |
| 3 肝炎病毒蛋白反式激活基因的克隆化 |
四、丙型肝炎病毒核心蛋白抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定（论文参考文献）
- [1]呼吸道合胞病毒全人中和抗体制备、表位鉴定及应用研究[D]. 伊春艳. 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所), 2019(07)
- [2]人源性TRAb Fab段抗体库的构建筛选与鉴定[D]. 杜晓明. 天津医科大学, 2012(08)
- [3]一个新的白细胞膜抗原ZCH-2B8a编码基因及其生物学特性的研究[D]. 郭莉. 浙江大学, 2006(08)
- [4]应用噬菌体展示技术筛选干扰素β基因启动子DNA结合蛋白的基因[J]. 钟彦伟,吴顺华,成军,徐东平,戴久增,高学松,曲建慧,王巧侠,李晓东,郭风劲,郭江,纪冬. 免疫学杂志, 2006(01)
- [5]丙型肝炎病毒多表位抗原基因pcx3的构建、表达及免疫原性研究[D]. 陈丽珊. 复旦大学, 2005(02)
- [6]功能基因组学与肝脏疾病研究[J]. 成军. 世界华人消化杂志, 2004(01)
- [7]丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达[J]. 钟彦伟,成军,张忠东,李强,李莉,陈菊梅. 解放军医学杂志, 2004(01)
- [8]噬菌体表面展示技术的新发展及在病毒性肝炎研究中的应用[J]. 成军. 解放军医学杂志, 2004(01)
- [9]病毒性肝炎发病机制相关基因克隆化的研究策略[J]. 成军. 解放军医学杂志, 2003(09)
- [10]噬菌体表面展示技术筛选HCBP6人源单链可变区抗体[J]. 钟彦伟,成军,张忠东,孙敏,李强,李克,王琳,李莉,张玲霞,陈菊梅. 世界华人消化杂志, 2003(04)