一、HBV PreS2+S/IFN-α融合基因真核表达载体的构建及其表达（论文文献综述）
吉萍[1]（2012）在《HBV外膜蛋白结构域的稳定表达及治疗性抗体的研究》文中认为乙型病毒性肝炎，简称乙肝，是一种由乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染机体后所引起的疾病。乙肝流行面广、传染性强、易于慢性化和重症化，并且以人类为惟一宿主，因此对人类健康造成了很大伤害。HBV是一种嗜肝DNA病毒，主要存在于肝细胞内并损害肝细胞，引起肝细胞炎症、坏死、纤维化。HBV感染肝细胞的机理比较复杂，尚未完全明确。目前，控制乙型肝炎传播最为直接和有效的措施是接种乙肝疫苗。在HBV感染期间，肝细胞大量分泌20nm的外膜主蛋白颗粒，由细胞系或酵母方法制备的同样颗粒就是有效预防病毒感染的疫苗。乙肝疫苗经历了乙肝病毒外膜主蛋白（即S蛋白，HBsAg）重组疫苗；乙肝病毒外膜主蛋白、中蛋白（前S2蛋白+S蛋白）及大蛋白（前S1蛋白+前S2蛋白+S蛋白）重组疫苗；乙肝DNA疫苗等几个阶段。这些疫苗虽然能够有效地降低HBV母婴传播的发生率，然而在人体保护率、抗体应答水平、免疫持久性等方面还存在一定的问题。因此，寻找免疫原性更强的HBV疫苗成为当前研究的热点。HBV的外膜由开放读框S基因（S-ORF，核苷酸nt2854-0-832）编码合成，包括3种外膜成分：大蛋白（L），中蛋白（M）和主蛋白（S），它们由1个开放读码框编码，分别使用3个起始密码子和1个共同的终止密码子。外膜蛋白主要是由226个氨基酸组成的主蛋白HBsAg，是携带全部抗原反应性的结构蛋白。M是在S的氨基端扩加55个氨基酸（前S2蛋白），前S2蛋白在外膜三种蛋白成分中的免疫原性最强；L是在M前再扩加108-119个氨基酸（前S1蛋白）。病毒附着于肝细胞，最重要的介导部位就是前S1蛋白的氨基端21-47肽段，前S1/AA21-47区段比较保守，只要这一段完整，变异的病毒就具有传染性。因此，在构建HBV主蛋白疫苗的基础上加入其他蛋白成分，如前S1蛋白、前S2蛋白以及C蛋白等会有助于提高疫苗的免疫原性。乙肝病毒的外膜蛋白在病毒颗粒分泌、附着及入侵新细胞中具有重要的介导作用，而且三种外膜蛋白均有较多的抗原表位。因此，构建同时含有preS1、preS2的蛋白可以更好的诱导机体的免疫应答。本课题依照这个思路，以获得具有更高免疫原性的HBV疫苗为目的进行基础性探索，主要研究内容及结论如下：第一部分：HBV/preS1-preS2-HBsAg真核表达载体的构建及在293细胞中的表达。根据外膜蛋白的跨膜特性将大外膜蛋白人为地分为6段并设计了6对引物，经PCR扩增后，分别使扩增产物在前S1、前S2编码区的5’端加入尿激酶原的信号肽序列、6*组氨酸（HIS），3’端加入HA标签的编码序列和EGFP片段。这6段扩增产物含有跨膜区的编码序列。由于HBV前S1的氨基端锚定于细胞膜上，本实验设计PCR扩增产物不含有前S1蛋白氨基端前11个氨基酸的编码区。构建好的载体转染人肾上皮293细胞，以观察绿色荧光，Westernblotting及激光共聚焦等方法检测蛋白在细胞内外的表达情况。最后获得了可以较高表达目的蛋白的HBV/（preS1-preS2-HBsAg）pcDNA3.1/293细胞株，为下一步探讨治疗性疫苗的研究提供了参考。第二部分：HBV/（preS1-preS2-FC）、HBV/（preS1-FC）真核表达载体的构建及在293细胞中的表达和纯化。根据第一部分的提示和结果设定采用重叠延伸PCR方法连接信号肽与各目的基因，将编码乙肝病毒S1抗原、S2抗原和连接入含有人IgG1Fc段的pcDNA3.1表达载体。其中加入人IgG1Fc段可以提高免疫原性，应对目前乙肝疫苗存在的抗体应答水平和免疫保护率不高等不足。采用阳离子脂质体法转染293细胞，经G418加压筛选阳性克隆。最后获得了可以较高表达目的蛋白的HBV/preS1-preS2-Fc、HBV/（preS1-FC）pcDNA3.1/293细胞株。
刘泽[2]（2011）在《口服沙门菌递送治疗性HBV-HSP70融合DNA疫苗的实验研究》文中进行了进一步梳理慢性乙型肝炎（CHB）严重危害人类健康,临床上尚无理想治疗手段,目前主要用核苷类药物和干扰素进行治疗,但是并不能完全治愈乙型肝炎,且长期使用会使HBV产生耐药突变并具有较大的副作用。乙型肝炎病毒感染人体后发生慢性化的主要原因是被感染者缺乏有效的特异性细胞免疫,无法清除体内的病毒。DNA疫苗由于在诱导机体特异性细胞免疫应答方面的优势,被广泛关注。但是经过多年来的研究,DNA疫苗仍未走进临床,重要原因之一就是随着受试动物体形的增大,DNA疫苗诱导免疫应答的能力迅速下降；此外缺乏满意的递送方式也是DNA疫苗发展的主要阻碍。因此,如何在安全的前提下,采取有效的递送方式和加强诱导的免疫应答,特别是加强细胞免疫应答水平,是目前研制有效DNA疫苗的关键问题。使用分枝杆菌热休克蛋白70羧基端（HSP70c）或T细胞刺激表位（HSP70t）基因构建融合基因疫苗可以起到佐剂的作用,同时减少机体针对HSP70的免疫应答。利用携带DNA质粒的减毒伤寒沙门菌口服,可直接将DNA质粒递送至抗原呈提细胞,极大提高DNA疫苗的利用率,同时口服的免疫方式安全方便,易于为患者接受。使用DNA疫苗初次免疫-痘苗病毒Ankara株（MVA）载体疫苗加强免疫的策略也可以有效增强机体的免疫应答。采取多种免疫增强策略综合应用,可以更好的优化DNA疫苗的免疫效果。本研究通过HBV基因与HSP70c或HSP70t基因构建融合基因疫苗、使用口服减毒伤寒沙门菌递送DNA疫苗和利用MVA载体疫苗强化免疫等多种手段,探索提高HBV DNA疫苗诱导特异性免疫应答的更佳优化条件。首先,将乙肝病毒preC/C基因或preS2/S基因、HSP70c基因或HSP70t基因分别先后插入VR1012载体,获得含HBV preC/C-HSP70c、HBV preC/C-HSP70t、HBV preS2/S-HSP70c和HBV preS2/S-HSP70t融合基因的DNA疫苗。再将构建好的重组DNA疫苗转染HepG2细胞,ELISA法和化学发光法检测目的抗原,证实重组DNA疫苗可以正确表达目的蛋白并具有抗原性。然后,将重组DNA疫苗电转化减毒伤寒沙门菌SL7207,获得稳定的携带重组DNA疫苗的重组减毒沙门菌。最后,分别采用HBV DNA疫苗肌肉注射初次免疫+MVA载体疫苗腹腔注射加强免疫、HBV-HSP70融合DNA疫苗肌肉注射初次免疫+MVA载体疫苗腹腔注射加强免疫、携带HBV DNA疫苗的重组减毒沙门菌口服初次免疫+MVA载体疫苗腹腔注射加强免疫和携带HBV-HSP70融合DNA疫苗的重组减毒沙门菌口服初次免疫+MVA载体疫苗腹腔注射加强免疫的方案,免疫Balb/c小鼠,收集血清和脾淋巴细胞检测特异性免疫应答。体液免疫方面,采用ELISA检测血清特异性抗体,结果显示各实验组均可诱导小鼠产生特异性抗体,抗体产生的时间和水平的差异无统计学意义。细胞免疫方面通过流式细胞术检测CD3+CD4+/CD3+CD8+T细胞比值评估非特异性细胞免疫水平,ELISpot检测肽刺激脾淋巴细胞分泌IFN-γ评估特异性细胞免疫效果,结果显示无论是特异性还是非特异性细胞免疫,HBV-HSP70融合DNA疫苗优于普通DNA疫苗,HBV-HSP70t融合DNA疫苗优于HBV-HSP70c融合DNA疫苗。使用减毒沙门菌口服递送DNA疫苗与裸DNA疫苗肌肉注射所诱导的细胞免疫应答水平相当。实验结果为治疗性HBV DNA疫苗的应用研究打下了基础。
张德庆[3]（2011）在《C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究》文中研究说明近年来,随着分子生物学、免疫学理论和技术的发展,运用基因重组表达技术研制预防、治疗用生物制品己经成为免疫学领域研究的热点,其中核酸（DNA）疫苗倍受青睐。该疫苗是继灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗及基因工程疫苗后的新一代疫苗。核酸疫苗具有同时激发机体体液和细胞免疫应答、使用安全、易于生产等优点,并可将多种基因联合在一起制成基因联合疫苗。然而由于DNA疫苗蛋白表达量低,激发的免疫应答较弱,从而限制了其开发应用速度。因此,提高DNA疫苗的免疫效果已成为基因免疫研究中急需解决的问题;目前常采用新型分子佐剂,如白细胞介素、干扰素、胸腺肽和补体分子佐剂等是提高DNA疫苗免疫效果的重要措施,其中补体C3d分子佐剂倍受人们的关注。补体C3d分子是补体C3被抗原激活以后的最终裂解片段,能够促进抗原提呈细胞对抗原的摄取、提呈作用,增强机体的免疫应答能力。因此,C3d已经成为核酸疫苗有效的新型分子佐剂。但是C3d作为分子佐剂具有种属差异性,不同种动物间C3d免疫增强作用的差异性需要作进一步的研究。PRRSV GP5基因编码的GP5蛋白为糖基化囊膜蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性,能诱导机体产生特异性体液免疫和细胞免疫。invH基因是沙门氏菌A-E群的高度保守基因,编码吸附和侵袭上皮细胞表面的蛋白,该蛋白决定沙门菌对肠粘膜细胞的侵袭力。本研究首先对哺乳动物猪、鼠的C3d基因进行克隆及序列测定分析,并探讨了不同种动物（猪、鼠、鸡、鸭）间补体C3d在基因水平上的相关性和差异性,然后以PRRSV GP5为模型基因,利用鼠、猪（哺乳动物）C3d的受体结合功能区p28和鸡、鸭（禽类动物）C3d的受体结合功能区p29作为分子佐剂,构建了C3d-p28（29）.n（n=2、4、6）多聚体分子佐剂PRRSV GP5核酸疫苗和沙门氏菌pcDNA3.1-invH-mC3d -p28.6核酸疫苗;用构建的核酸疫苗免疫小鼠并对其免疫效果进行了体液和细胞免疫主要指标的检测,探讨不同动物C3d-p28（29）对核酸疫苗的免疫增强作用。本研究主要包括四部分内容:1、哺乳动物猪、鼠补体C3d基因的克隆及序列分析:为了获得哺乳动物（猪、鼠）的补体C3d基因克隆并比较同禽类动物（鸡、鸭）C3d基因序列的差异性,首先从哺乳动物鼠、猪的肝组织中提取总RNA,通过RT-PCR扩增C3d基因的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定并进行序列测定,然后进行C3d序列和CR2结合区同源性比较分析。电泳结果显示,分别在936bp和888bp处呈现明亮的条带,成功获得了鼠和猪的C3d基因克隆。序列分析结果表明,哺乳动物（猪、鼠）和禽类（鸡、鸭）的补体C3d基因同源性仅为64%;进化树显示,哺乳动物与禽类的亲缘关系越近,C3d基因进化关系也越近。哺乳动物（猪、鼠）与禽类（鸡、鸭）C3d基因的CR2结合区比较分析发现,禽类为29个氨基酸,而哺乳动物为28个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为62%,而鼠、猪两种哺乳动物之间、鸡、鸭两种禽类动物之间的同源性分别达82.8%和84%,证明补体C3d及CR2结合区具有种属的差异性。2、不同动物C3d分子佐剂PRRSV GP5核酸疫苗的构建:为探明不同动物C3d分子佐剂在核酸疫苗中的免疫增强作用,在上述试验克隆了动物C3d cDNA的基础上,设计引物克隆C3d-p28（29）至pUC19载体,利用同裂酶BamHⅠ和BglⅡ构建多聚体C3d-p28（29）.n,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）上;然后以RT-PCR扩增的PRRSV GP5基因作为模式基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1-C3d-p28（29）.n中p28（29）.n上游,构建pcDNA3.1-GP5-C3d-p28 （29）.n重组质粒。酶切结果显示,电泳后在807、987、1167bp处分别出现了明亮的条带,表明成功构建了含有补体C3d-p28（29）多聚体分子佐剂的PRRSV GP5核酸疫苗（pcDNA3.1-GP5-C3d-p28（29）.n）。3、不同动物C3d分子佐剂对PRRSV GP5核酸疫苗免疫增强效果研究:为了探索不同动物C3d分子佐剂对PRRSV GP5核酸疫苗的免疫增强作用及差异性,在构建了鼠、猪、鸡、鸭四种动物补体C3d-p28（29）.n PRRSV GP5核酸疫苗（pcDNA3.1-GP5-C3d-p28（29）.2.4.6）及pcDNA3.1-GP5核酸疫苗的基础上,分别提取质粒,通过脂质体转染至Marc145细胞进行瞬时表达,并免疫BALB/c小鼠,然后利用不同ELISA试剂盒分别检测各免疫组小鼠的GP5抗体水平和IL-4、IFN-γ含量。结果表明,以补体C3d-p28（29）.n为分子佐剂的PRRSV GP5基因重组疫苗均可在Marc145细胞内进行表达;连接不同动物C3d-p28（29）2,4,6聚体的核酸疫苗免疫鼠血清中GP5抗体水平、IL-4和IFN-γ含量均比空载体（pcDNA3.1）和pcDNA3.1-GP5对照组的升高,差异均显着（P<0.05）,其中以pcDNA3.1-GP5-p28（29）.6组的效果最佳,但均不如PRRSV油乳剂灭活苗组的效果好。另外,含有C3d-p28（29）.n（n=2,4,6）相同聚体的疫苗免疫组小鼠血清中的GP5抗体水平、IL-4和IFN-γ含量两两比较无差异性。4、鼠C3d分子佐剂沙门氏菌invH基因核酸疫苗的构建及免疫效果研究:为了进一步探讨分子佐剂C3d在细菌核酸疫苗中的免疫增强作用,以沙门氏菌invH为核酸疫苗的模式基因,构建了pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6重组质粒,免疫BALB/c小鼠并检测了小鼠血清中invH抗体和IL-4、IFN-γ的含量,然后进行小鼠攻毒保护试验。结果表明,小鼠血清中invH抗体水平、IL-4和IFN-γ的含量与pcDNA3.1、pcDNA3.1-invH对照组比较,差异均显着（P<0.05）。通过攻毒试验结果表明,pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6核酸疫苗对小鼠的免疫保护率高于pcDNA3.1-invH组,差异显着（P<0.05）,与空白组和pcDNA3.1组比较,差异均极显着（P<0.01）,但核酸疫苗的保护效果不及灭活疫苗。本研究结果探明了动物C3d分子佐剂对病毒及细菌核酸疫苗的免疫增强作用,为开发利用不同动物C3d分子佐剂研制其他病原的核酸疫苗提供了理论依据和技术支持。
刘菲[4]（2011）在《天府肉鹅α干扰素基因克隆、表达及其生物学活性研究》文中提出我国是水禽生产大国,天府肉鹅具有良好的遗传特性,在整个西南地区的占有率很高,养殖规模较大,社会和经济效益显着。随着集约化养鹅业的发展,研究开发出能有效增强鹅疫苗的免疫力和对鹅病毒具有抑制或杀灭作用的生物制剂,对鹅病的有效防治具有重要的意义。IFN-α干扰素具有良好的广谱抗病毒活性和有效的免疫调节功能。本研究采用基因工程及相关技术,借鉴相关研究,对天府肉鹅IFN-α（tf-GoIFNα）进行克隆、表达及其功能与应用研究。1天府肉鹅干扰素-α基因的克隆及生物信息学分析采用RT-PCR法从天府肉鹅外周血单核细胞中扩增出其IFN-α基因（tf-GoIFNα）;并将上述扩增片段克隆到pMD18-T载体中,构建重组质粒。用生物信息学软件及在线分析方法对tf-GoIFNα基因的核酸及氨基酸序列进行分析,同时分析13个与其相关的基因序列的相似性及进化情况。实验结果表明,tf-GoIFNα克隆成功,完整的ORF基因全长576个核苷酸,编码191个氨基酸,表达蛋白分子质量为21670.7Da,潜在的信号肽切割部位位于第28位的A（丙氨酸）和第29位的F（苯丙氨酸）氨基酸之间,二级结构主要由0-螺旋（H）和无规则卷曲组成,大致包括10个抗原表位；tf-GoIFNα基因编码的氨基酸序列含有2个潜在的N-糖基化位点,9个潜在的O-糖基化位点,含有5个潜在的磷酸化位点,第一个疏水区同信号肽位置一致,提示信号肽引导蛋白分泌到胞外作用,没有跨膜区,亚细胞定位预测,tf-GoIFNα表达的蛋白大约会有55.6%在细胞外,22.2%在细胞质,l 1.1%在线粒体,11.1%在细胞核；序列分析及比较结果显示tf-GoIFNα与同类的水禽（鸭、鹅）有90%之上的相似性,在进化树中位于同一分支。与狮头鹅的同源性最近,其中核酸相似性达到99.3%,氨基酸相似性达到97.9%；基因密码子特征分析表明,本研究所克隆的tf-GoIFNα为高表达、密码子偏性较高的基因,其密码子偏爱性情况与鸭IFN-α相近,与鸡IFN-α基因的密码子偏爱性有所不同,提示可以参照和借鉴已经开展的鸭IFN-α基因的表达,开展tf-GoIFN-α的表达及进一步的深入研究。2 tf-GoIFN-α成熟肽基因的原核表达及抗病毒活性检测参照已克隆的tf-GoIFNα完整ORF基因序列设计引物,克隆到了成熟肽基因,基因全长486bp。将成熟肽基因与原核表达载体pET32a连接,构建原核表达载体pET32-mtf-GoIFN-α,并于表达菌Rosetta中表达,成功表达大小为38kDa的蛋白。表达蛋白经过Ni-IMAC亲和层析纯化以及稀释透析复性后,SDS-PAGE显示蛋白己纯化为单一条带。采用微量细胞病变抑制法分析测定IFN的抗病毒活性,纯化复性的重组质粒pET32-mtf-GoIFN-α表达蛋白抗VSV活性为104U/mL,比活性为5.5×103U/mmg。并且在GEF和DEF中检测到鹅IFN-α重组蛋白抗VSV效果是一致的。SYBR Green real-time PCR检测,复性后的tf-GoIFNα重组蛋白进行抗GPV,IFN保护组以及GPV组病毒拷贝数之间存在显着性差异（P<0.05）,tf-GoIFNα重组蛋白具有抗GPV的活性作用,对GPV病毒的相对抑制率达89.4%。3鹅IgG的提取纯化及兔抗鹅IgG酶标抗体的制备为了研究兔抗鹅IgG酶标抗体的制备,试验采用水稀释-辛酸-硫酸铵法粗提,透析除盐,DEAE50纤维素层析相结合的方法提取鹅卵黄IgG,经核酸蛋白检测仪和SDS-PAGE测定IgG浓度,制备兔抗鹅IgG酶标抗体。结果表明：粗提的IgG浓度为10mg/mL,抗体纯度可达到94.5%；免疫扩散得出兔抗鹅IgG抗血清效价约1：32,抗体酶标后效价为1：3000,具有应用价值。4 tf-GoIFN-α真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的瞬时表达为了进一步研究tf-GoIFNα基因的特性和功能,将tf-GoIFNα基因克隆到pcDNA3.1-（+）真核表达载体上,构建重组质粒pcDNA3.1-GoIFN-α,脂质体介导将其转入COS-7细胞,应用间接免疫荧光、ELISA和Western-blot法检测GoIFN-α基因在COS-7细胞中的转录和表达情况,并对COS-7细胞表达上清液进行抗病毒活性检测。结果表明,真核表达载体pcDNA3.1-GoIFN-α构建成功,目的蛋白在转染12h后就可以被检测出,36h前目的蛋白在上清液中快速增加,之后增加速度变慢；重组质粒能够在COS-7细胞内得到高效表达,表达的蛋白分子量为38kDa,比预测的分子质量（约21kDaA）大；间接免疫荧光显示,tf-GoIFNα基因产物由细胞核向细胞浆发散；表达产物经细胞病变抑制法测定,显示出具有明显的抗猪水泡性口炎病毒（VSV）及小鹅瘟病毒（GPV）的活性。5tf-GoIFN-α真核表达质粒对GPV-VP3基因疫苗的免疫佐剂效应为检测tf-GoIFN-α真核表达质粒（pcDNA-GoIFN-α）对GPV-VP3基因疫苗的佐剂作用,将pcDNA-GoIFN-α以每只50、100、200μg三个剂量与GPV-VP3基因疫苗一起用肌肉注射法分别免疫28日龄鹅,同时设分子佐剂gIL2对照组、分子佐剂GoIFN-α与gIL2联合免疫佐剂组、空载体质粒pcDNA3.1（+）对照组、小鹅瘟弱毒对照组和空白对照组,接种后第3、7、14、21、28、35、49d采抗凝血用淋巴细胞增殖试验（MTT法）测定鹅外周血T淋巴细胞转化；第3、7、14、21、28、35、49、63、77 d采凝血用间接ELISA法以及中和试验检测血清抗体水平。结果显示：（]）淋巴细胞对ConA的反应能力（OD值）pcDNA-GoIFN-a以不同剂量与GPV-VP3基因疫苗一起免疫鹅后,各实验组的T淋巴细胞增殖反应在第3d基本维持同一水平,从第3d到第28d稳步上升,在28 d达到了最高峰,而pcDNA-VP3免疫组在第35d达到高峰。在第28d,佐剂组的OD值均极显着（P≤0.01）高于pcDNA-VP3基因疫苗组、GPV弱毒组、pcDNA3.1 （+）和生理盐水对照组。GoIFN-α佐剂组只在第21d显着（P<0.05）高于gIL2佐剂组,其他时间点差异不显着。联合佐剂组在第14d、第28d到第49d均显着高于GoIFN-α或gIL2佐剂组（P<0.05）。（2）外周血抗体IgG水平（OD值）佐剂免疫组的ELISA抗体水平从第3d的增长趋势为先慢后快,至第35d到达最大值,之后逐渐下降,但仍明显高于pcDNA-VP3基因疫苗组和GPV弱毒组。gIL2佐剂组在第28d到第42d和63d到第77d显着高于GoIFN-α佐剂免疫组（P≤0.05）,GoIFN-α和gIL2联合佐剂免疫组在第21d到第77d极显着高于GoIFN-α或gIL2单独佐剂免疫组（P≤0.01）。在GoIFN-α佐剂组中,佐剂作用呈一定的剂量相关性。（3）外周血中和抗体效价在免疫后第60d和第75d,GoIFN-α/gIL2联合佐剂组极显着（P≤0.01）高于GoIFN-α或gIL2佐剂组（表8-5）。佐剂组的中和抗体效价在第45d到第75d期间均显着（P≤0.05）或极显着（P<0.01）高于pcDNA-VP3组。GPV弱毒组在第45d显着高于GoIFN-α或gIL2单独佐剂组诱导的中和抗体水平（P≤0.05）,与GoIFN-α和gIL2联合佐剂组所诱导的中和抗体水平差异不显着。整个检测过程中,注射pcDNA3.1（+）和生理盐水的鹅对照血清不能保护细胞对抗病毒的感染。实验证明,pcDNA-GoIFN-α能使GPV-VP3基因疫苗诱导的T淋巴细胞转化能力增强,血清抗体IgG水平和中和抗体效价升高,是一种良好的增强GPVVP3基因疫苗的分子佐剂,分子佐剂goIFN-α和golL2联合免疫组效果最佳,pcDNA-goIFN-α肌肉注射200μg/只的效果次之。6 tf-GoIFNα在毕赤酵母中的分泌表达及其活性检测为了更好的利用基因工程技术来开发重组鹅IFN-α制剂,应用PCR技术从含有tf-GoIFNα完整ORF的重组质粒pMD18-T-GoIFN-α中扩增鹅α干扰素的成熟肽基因,亚克隆于穿梭载体pPICZαA上,构建重组酵母表达质粒pPICZαA-GoIFN-α;重组质粒经sacⅠ线性化后,电转化入酵母表达菌X33；1%的甲醇诱导表达3株不同的菌72小时后,斑点杂交筛选出高拷贝的转化子,Elisa法鉴定筛选最佳表达时间和甲醇浓度。重组子经诱导表达,TCA浓缩后,SDS-PAGE和Western-blot分析,并采用微量细胞病变抑制法分析研究其生物活性。结果表明,成功构建了重组鹅IFN-α的酵母表达质粒,并实现了其在毕赤酵母中的分泌表达；SDS-PAGE和Western-blot分析显示获得分子量约为22kDa的表达蛋白,比预测的蛋白分子量（18.7kDa）略大,估计是糖基化的原因；表达产物对水泡型口炎病毒在鹅胚成纤维细胞中可起抑制作用,抗病毒活性为1.79×103U/mL。
刘栋[5]（2010）在《畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究》文中认为在生产实践中,传统的疫苗（弱毒苗、灭活苗）对防治动物疫病发挥了重要作用,但近年来该类疫苗暴露出来的免疫效果不佳等缺陷,使研制更安全、高效、廉价的新型疫苗显得非常迫切和必要。基因疫苗主要由真核表达载体和保护性抗原基因构成,此种疫苗与传统疫苗相比,具有设计灵活、安全性高、性质稳定、成本低、同时诱导体液免疫和细胞免疫等优点。然而核酸疫苗存在的问题是产生抗体慢且水平低,需要加入有效的佐剂才能克服这些缺陷;核酸疫苗的佐剂需用分子佐剂,分子佐剂主要有干扰素分子佐剂、白细胞介素分子佐剂、胸腺肽分子佐剂及C3d分子佐剂等,其中C3d分子作为一种新型分子佐剂日益引起人们的关注。补体C3是机体补体激活的经典途径、替代途径以及甘露聚糖结合凝集素（MBL）途径的交汇点的中心成分,是宿主防御机能的一个分子。C3d片段是补体C3的裂解片段之一,是C3分子α链不能被蛋白酶再裂解并仍保持与抗原共价连接的最小片段,具有广泛的免疫学功能。其可以直接与抗原递呈细胞（APC）上的CR2受体结合,从而降低淋巴细胞的活化阈,提高抗原分子的免疫原性。因此,C3d被认为是一种具有研究、开发应用价值的核酸疫苗分子佐剂。鉴于上述研究背景,本研究在对不同动物补体C3d基因克隆及序列测定比较分析的基础上,探讨了补体C3d在不同畜禽间基因水平上的相关性和差异性;验证了鸡补体C3d原核表达重组蛋白（rChC3d）对大肠杆菌疫苗和新城疫灭活油乳苗的免疫增强作用;然后采用新城疫病毒F基因为试验材料、以鸡补体C3d的受体结合功能区P29作为分子佐剂,构建了C3d-P29.n（n=2、4、6）多聚体分子佐剂新城疫F基因疫苗,并经过检测证明了其具有较好的免疫保护效果。本研究成果为以后研制禽类的其他有效细菌及病毒性疫苗提供了理论基础和技术支撑。本研究主要内容如下:1、不同畜禽补体C3d基因的克隆及序列分析:从不同畜禽的肝细胞提取总RNA,通过RT-PCR扩增出C3d基因的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定后进行序列测定,然后进行C3d序列比较、CR2结合区同源性分析比较。结果表明,畜禽补体C3d基因同源性相差较大,进化树反映出C3d基因具有种的多样性,亲缘关系越近,进化关系也越近。对CR2结合区分析发现,禽类的该区为29个氨基酸,而哺乳动物的为28个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为40%,而哺乳动物之间的同源性高达80%,证明补体C3d及CR2结合区具有种属的特异性。另外,用生物学软件对补体C3d基因编码的氨基酸序列以及蛋白结构进行了分析、用ESyPred 3D同源建模等软件对补体C3d的三级结构进行了三维结构预测和分子特征分析,分析结果显示,C3d 3D模型是一种由核心和外层构成的桶状分子结构。本研究为进一步研究动物C3d分子佐剂基因疫苗奠定了基础。2、鸡补体C3d原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化:补体C3d是补体系统（Complement system,CS）中补体C3的最终裂解产物。为研究其免疫增强的生物学功能,利用RT-PCR技术从罗曼蛋鸡肝脏总RNA中扩增出C3d cDNA,经克隆测序证实所得基因为C3d。然后,将其连接至表达载体pET-32a（+）,转化E. coli BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,目的基因在大肠杆菌中以包涵体的形式进行了高效表达,Western-blotting证实目的蛋白为C3d。包涵体蛋白通过尿素溶解液洗涤并溶解后,经硫酸铵盐析、透析、浓缩和Sephadex G-200凝胶过滤层析,重组C3d蛋白得到纯化。最后,SDS-PAGE及Western-blotting检测验证该C3d表达蛋白得到很好的纯化,并且纯化后的表达蛋白仍具有良好的反应原性。本研究为进一步研究、利用鸡补体C3d蛋白提供了保证。3、鸡补体C3d重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究:从SDS-PAGE凝胶中分离纯化原核表达的重组C3d蛋白,用戊二醛将其与大肠杆菌抗原连接,免疫注射SPF鸡;对照组鸡免疫注射完全弗氏佐剂大肠杆菌疫苗。分别在免疫后的第2、3、4、5、6、7、8、9周采血,用ELISA方法测定血清中的抗体含量,同时测定血清中总补体活性。结果表明,免疫后3周,弗氏佐剂大肠杆菌疫苗诱导鸡体产生的抗体效价高于C3d佐剂疫苗组,但至第4周,弗氏佐剂疫苗组的抗体水平达到高峰（OD值=0.273±0.044）,然后迅速下降,到第9周降至0.200±0.055,而C3d疫苗组鸡免疫后的抗体水平持续上升,从免疫后第2周的0.099±0.030上升到第9周的0.275±0.020。证明原核表达的C3d能够促进免疫记忆细胞的产生,并能够使细菌抗原给予免疫细胞持续稳定的刺激,从而使鸡体维持高水平抗体的时间延长。研究结果为研制有效的家禽细菌性疫苗提供了理论依据。4、鸡补体C3d重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究:为进一步探讨重组鸡补体C3d蛋白的佐剂作用,本试验观察了原核表达纯化后的重组鸡补体C3d蛋白和新城疫灭活油乳苗共同免疫鸡群之后,重组鸡补体C3d蛋白对新城疫灭活油乳苗的免疫协同作用。将7日龄雏鸡分为三组进行免疫注射,作用结果显示联合免疫灭活油乳苗和重组鸡补体C3d蛋白的鸡群,在免疫后1～7周（即14～57日龄）整个观察期内,不但其胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA的反应均明显强于单纯油乳苗免疫组（其中除在接种后第1周时两组鸡的B淋巴细胞增殖OD值差异不显着外,其余各检测时间两组间均表现为差异显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）,特别是T淋巴细胞增殖情况在接种第2周后均表现为差异极显着（P<0.01））;而且联合免疫组的HI抗体效价水平也持续性高于单纯油乳苗免疫鸡群,并在免疫接种后5～7周时差异显着（P<0.05）。在免疫接种后第7周时进行的攻毒保护试验中,联合免疫组的保护率为100%,而单纯油乳苗免疫组鸡在观察期内则有3只发病,保护率为83.3%,且有1只死亡。总之,本试验所用重组鸡补体C3d蛋白和灭活油乳苗联合免疫可显着提高机体的体液免疫和细胞免疫水平,产生了较好的免疫协同作用,使机体对新城疫病毒的综合免疫保护能力得到进一步的增强,从而初步验证了重组C3d蛋白的免疫佐剂作用。5、新城疫病毒C3d-P29分子佐剂F基因疫苗的构建及其表达:C3d是补体C3的裂解产物之一,与抗原相连时可以明显提高抗原分子的免疫原性。CR2/CD21在其功能发挥过程中起到重要作用,P29为编码C3d与CR2结合区域的基因。在克隆出C3d cDNA基础上,设计引物克隆P29至pUC19载体,利用同裂酶BamH I和Bgl II构建pUC-P29.n。酶切获得P29.n,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）。最后RT-PCR扩增新城疫F基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA-P29.n中P29.n的上游,构建完成新城疫F基因疫苗,用IFA法检测pcDNA-F-C3d-P29.n可在CEF中大量表达。本研究为进一步研究补体C3d的分子佐剂效应以及开发和利用鸡C3d奠定了基础。6、鸡C3d-P29重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3含量的初步研究:为验证鸡补体C3d-P29分子佐剂作用,本试验比较研究了免疫注射含有鸡C3d-P29基因重组表达质粒之后的鸡血清中补体水平及其补体C3含量与含有异种动物（如小鼠）CR2结合区基因序列重组质粒或空白对照之间的差异,以探讨鸡补体C3d基因重组质粒能否特异性的增强鸡补体总活性与补体C3含量。根据构建的真核表达重组质粒不同分为五组对鸡进行免疫注射,具体为空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组;含有新城疫F基因的pcDNA3.1-F组;含有新城疫F基因以及鸡CR2结合区（P29）基因序列C3d-P29六聚体的pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组;含有新城疫F基因以及小鼠CR2结合区（P28）基因序列C3d-P28六聚体的pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组。分别采取各组经二免后成年鸡的新鲜血清,测定其补体总活性;利用生化合成的C3α链N端21肽,经免疫家兔后制备的抗鸡C3抗体,具有能够与鸡血清中的补体C3发生特异性反应的特性,用来测定注射过不同真核表达质粒后鸡血清中C3含量差异。结果表明,空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组; pcDNA3.1-F组; pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组和pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组五个试验组鸡血清中的补体C3含量分别为0.34±0.005mg/mL、1.47±0.008mg/mL、1.70±0.005mg/mL、1.78±0.007mg/mL和4.18±0.008mg/mL。免疫鸡补体C3d（pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组）的鸡血清中补体总活性和C3含量都远远高于其他组,差异极显着（P<0.01）;并且鸡C3d重组质粒能特异性增强鸡补体总活性与C3含量,差异极显着（P<0.01）。7、新城疫补体C3d分子佐剂疫苗免疫效果的研究:在克隆了鸡C3d cDNA和新城疫F48E9株F基因cDNA的基础上,构建编码CR2结合区P29基因的多聚体,以此多聚体为分子佐剂构建了新城疫F基因疫苗pcDNA3.1-F-C3d-P29.2、pcDNA3.1-F-C3d-P29.4、pcDNA3.1-F-C3d-P29.6及pcDNA3.1-F,通过了实验室安全检验和效力检验。将含有不同个数P29基因的多聚体作为分子佐剂的新城疫F基因疫苗、新城疫油乳剂灭活苗以及质粒载体作为对照分别免疫SPF鸡,利用MTT法、血凝抑制法（HI）和ELISA等分别检测不同疫苗免疫后的细胞免疫和体液免疫水平,并在免疫后第五周进行了攻毒试验。最后,还进行了重组鸡补体C3d质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d蛋白（rChC3d）对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验。结果表明,以补体C3d-P29为分子佐剂的新城疫F基因重组疫苗安全性好;虽然免疫后抗体水平和保护率不如新城疫油乳剂灭活苗,但是能够抵抗致死量病毒的攻击,具有较好的保护作用,其中以pcDNA3.1-F-C3d-P29.6效果更好;MTT法测定T淋巴细胞转化结果表明,补体C3d-P29.6佐剂能显着促进淋巴细胞转化,多数时间点与油佐剂的效果相当,部分时间点显着强于油佐剂。MTT法检测pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果显示pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6免疫组峰值较rChC3d协同免疫组出现时间稍晚,但随后质粒免疫组可维持在更高的水平值。这表明pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6在体内持续的时间更长。本研究中C3d分子佐剂疫苗免疫效果的验证,为进一步开发和利用鸡C3d奠定了基础。
陈红梅,白雪帆,任广立[6]（2009）在《融合基因S2S/IFNα对小鼠免疫反应的影响》文中进行了进一步梳理目的探讨S2S/IFNα融合基因疫苗诱导HBV preS2S特异性体液免疫及细胞免疫应答的作用。方法pcDNA3.1S2S/IFNα作为实验组,设立pcDNA3.1S2S+pcDNA3 IFNα组、pcDNA3.1S2S组及空载体对照组作为对照组,免疫BALB/c小鼠。采用0、2、4周的方案接种,检测各次接种后抗体水平。初次免疫后7周,测定免疫脾细胞的杀伤活性、增殖活性、细胞因子的分泌水平及免疫脾细胞CD25的表达量。结果pcDNA3.1S2S/IFNα组小鼠抗体滴度、免疫脾细胞的杀伤活性和增殖活性、Th1型细胞因子的分泌水平及CD25表达量均比对照组明显增强。结论S2S/IFNα融合基因能诱导更强的特异性体液免疫及细胞免疫应答。
陈宗艳[7]（2008）在《DHBV侵染规律和preS蛋白原核表达及在评价抗人类乙肝新药的应用》文中进行了进一步梳理鸭乙型肝炎病毒（Duck Hepatitis B Virus,DHBV）与乙型肝炎病毒（Hepatitis BVirus,HBV）同属嗜肝DNA病毒科,这类病毒的特征是有强的嗜肝细胞特性,在病毒形态、基因组结构、复制过程等生物学特性相似。DHBV感染鸭模型是研究HBV的生物学特性、致病机制和抗HBV药物的实验动物模型。本文通过调查四川地区麻鸭自然携带DHBV的情况,分离DHBV毒株,以此毒株为模板,扩增主要抗原基因preS。通过构建DHBV-preS原核表达质粒并诱导表达,从而对表达蛋白免疫原性、表达蛋白抗体介导的免疫组化检测人工感染DHBV后在体内的蛋白定位分析与侵染规律,以期系统地了解的入侵方式和复制机理,为阐明DHBV的发病机制提供关键的实验数据。同时建立基于定量检测DHBV的FQ-PCR方法,用于DHBV疾病模型研究,并结合体外模型HepG2.2.15细胞研究抗乙型肝炎新药,结果如下:DHBV毒株的分离及分子特征解析结果表明:四川麻鸭自然携带DHBV 4%,证实四川麻鸭是研究实验性DHBV感染动物模型的良好鸭种;对分离到的其中3株DHBV阳性血清全基因克隆、测序并进行生物信息学分析,发现全基因组均含3006个核苷酸（GenBank登录号EU429324,EU429325,EU429326）,具有X-like开放阅读框特征;进一步研究ORF-S还表明该基因编码33个氨基酸,有四个疏水区,无N-糖基化位点,也无豆蔻酰化位点,在1～30aa内有一个明显的信号肽,在19～20aa处有断点,跨膜螺旋预测为外膜蛋白,抗原位点主要分布于preS区氨基酸序列中。根据DHBV-preS序列,设计一对特异性引物,以分离的DHBV毒株为模板扩增目标基因并将其克隆至pMD18-T载体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将DHBV-preS基因正向插入原核表达载体pET-32a（+）的ApaI和NcoI位点间,成功构建了重组表达质粒pET32a（+）/DHBV-preS。重组表达质粒pET32a（+）/DHBV-preS转化表达宿主菌BL21（DE3）,用IPTG诱导,能表达出了大小约为37kD的preS重组蛋白,与预期表达蛋白分子量大小相符;经对不同诱导时间及诱导剂IPTG浓度等条件进行优化,确定重组质粒pET32a（+）/DHBV-preS的最佳诱导条件为0.8mmol/LIPTG、37℃条件下诱导4h。表达产物用镍柱亲和层析纯化后,将得到的preS重组蛋白做梯度稀释,初步建立ELISA检测DHBsAb的方法（间接法）;同时将纯化的重组蛋白与等量弗氏佐剂混合制备preS重组蛋白免疫原,四次免疫家兔,获得的兔抗DHBV-preS高免血清经辛酸-硫酸铵粗提后,阴离子交换柱层析纯化抗体IgG。建立DHBV-preS基因表达蛋白抗体介导的免疫组化方法;针对DHBV的保守序列设计并合成引物及荧光标记探针,建立实时荧光定量聚合酶链反应（fluorsescencequantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR）检测方法。建立的标准曲线循环阈值（cycle threshold,Ct值）与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.993,将其检测极限的Ct值通过标准曲线换算成拷贝数约为5copies/L,未检测到鸭病毒性肝炎、鸭瘟病毒、鸭源致病性大肠埃希氏菌、鸭源致病性沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌,表明FQ-PCR检测DHBV方法灵敏、特异性强。采用鸭乙型肝炎病毒人工方法感染1日龄四川麻鸭,攻毒后于不同时间采血分离血清,采集肝脏、胰腺、肾脏、脾脏等组织或器官,经建立的DHBV-preS基因表达蛋白抗体免疫组化方法和FQ-PCR方法检测DHBV在感染鸭体内侵染过程与定位分布,并结合组织学和血液生化指标对DHBV在感染鸭体模型侵染规律进行系统观察。结果显示:感染后2d可在血清和肝组织中检测出DHBV DNA,血清中DHBV DNA从感染后第10d～30d DHBV DNA的拷贝数保持在1.00E+09以上,肝组织中DHBVDNA的含量从感染后第5d～52d保持在5.00E+09以上;肝脏DHBV DNA第14d达到最高水平,而血清中DHBV DNA第22d达到最高水平。肝脏、胰腺、肾脏、脾脏的损伤程度与DHBV DNA水平成正相关;在感染后3～52d内的不同时间点从肝脏、胰腺、肾脏、脾脏及大脑六种组织器官中检测出DHBsAg,DHBsAg主要分布在细胞浆,少部分分布于细胞核,未能从食道、腺胃、肺、心脏、生殖器和肌肉中检测到DHBsAg,表明DHBV嗜肝的同时具有泛嗜性,且在靶器官的侵染与分布具有一定选择性;在感染后1～3d、52d以后各组织相继不能检出DHBsAg,感染后12～31d病毒在机体内各组织的分布最为广泛,感染后4d肝脏开始出现DHBsAg阳性细胞,感染后6d肾脏、胰腺、脾脏相继开始出现DHBsAg阳性细胞,而脑组织在感染后10d出现阳性细胞;肝脏的检出率最高,持续至52d,大脑的检出率最低,分析表明该蛋白可能是膜蛋白,具有运输核浆与引导病毒组分进入核内参与病毒复制的功能。DHBV感染后第4d,总蛋白和白蛋白含量开始降低,谷丙、谷草转氨酶活性升高（P＜0.01）,乳酸脱氢酶活性升高（P＜0.01）,肌酐和尿素有变化但无规律,表现为升高趋势,感染后44d开始,各项血液生化指标逐渐趋于正常值,表明DHBV引起肝脏损伤的同时累及肾脏。在建立的抗人类乙型肝炎新药体内药效评价的技术平台和体外模型HepG2.2.15上评价抗乙型肝炎新研制药物-核苷类似物（代号PNA）的作用。在HepG2.2.15细胞系中,PNA有明确的抑制HBV DNA复制作用,抑制HBsAg和HBeAg,在7.8～62.5μg/mL剂量范围内有剂量—时间依赖关系,未见到明显细胞学毒性;在鸭乙肝动物模型中,PNA对DHBV DNA抑制率达50%的最低用药剂量为口服20mg/kg,口服40mg/kg、80mg/kg PNA对DHBV的抑制率与拉米夫定口服组（50mg/kg）基本一致,可以减轻鸭脏炎症,抑制DHBsAg在肝脏中的表达。
徐艳玲,金立杰[8]（2007）在《含前S基因的重组乙型肝炎疫苗研究进展》文中研究说明含乙型肝炎病毒前S抗原成分的新型重组乙肝疫苗具有更强的免疫原性,可使乙型肝炎疫苗无应答者产生抗体。本文介绍了前S蛋白的分子生物学活性,并对含前S基因的乙型肝炎疫苗的研究进展作一综述。
任晓慧[9]（2007）在《RNA复制子对基因表达的促进作用及动物促生长方法的探讨》文中研究表明本研究采用塞姆利基森林病毒（SFV）RNA复制子和微球（MP）介导基因转移技术,以期提高目的基因的表达水平。首先构建了GHRH和HBsAg-SS单基因以及GHRH-HBsAg-SS双基因RNA复制子真核表达载体,在细胞和小鼠肌肉中成功地表达了目的蛋白,且表达的HBsAg-SS具有反应原性。制备的MP-DNA复合物提高了目的基因的表达以及基因免疫水平;也证实了复制子载体对基因表达具有明显的促进作用,表达水平比普通载体高3倍,诱发抗体水平的升高也显着优于普通载体。微球介导的GHRH和HBsAg-SS基因直接转移,对小鼠和育肥猪均表现出明显的促生长作用。初步探讨了非遗传性获得的促生长机制,证实利用这项技术在大型哺乳动物产生两代间的,非遗传性生物效应的可能性。给妊娠母鼠和母猪进行GHRH和HBsAg-SS基因直接转移,后代表现出明显的促生长作用。同时也证实了GHRH与HBsAg-SS双基因共表达对动物的促生长具有协同作用。本研究为寻求高效的基因表达系统,实现对GH的双向调节,开发新一代提高动物生产性能的长效促生长制剂打下了基础。
梁晓红[10]（2006）在《HBV感染影响TRAIL诱导凋亡关键基因片段的筛选及其分子机制的研究》文中研究说明乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染肝细胞所致肝炎、肝硬化甚至肝癌是危及全世界，尤其是我国人民健康的重要原因。尽管到目前为止，HBV的确切致病机制尚存在争议，但已有研究证实，HBV感染所致肝细胞凋亡失衡不仅是乙肝患者肝细胞损伤的重要分子机制之一，而且在乙肝患者不同的预后、转归中发挥着不容忽视的、甚至是决定性的作用。 众多研究表明，TNFα、FasL等凋亡诱导分子在HBV感染所致肝细胞损伤中发挥重要作用。肿瘤坏死因子凋亡诱导配体（Tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL）是于1994年被克隆、命名的肿瘤坏死因子家族成员，其最为显着的特点是：可选择性地诱导肿瘤细胞或者病毒感染细胞的凋亡，而对正常组织细胞无明显毒性。研究发现，许多因素（病毒／病毒编码蛋白、射线、药物等）可改变细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性。我室在前期研究中首次提出并报道了，HBV感染可提高肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性，可能在HBV感染所致肝细胞损伤中发挥一定的作用。但是，HBV全基因组至少包含四个开放性读码框架（Open reading frame，ORF），编码合成相应病毒蛋白质，那么究竟哪一个片段是导致HBV影响TRAIL诱导凋亡的关键性基因区段呢?这些关键性基因区段在TRAIL诱导凋亡通路中的关键性作用位点又是什么呢?因此，在前期工作的基础上，本课题在国内外率先开展了有关HBV影响TRAIL诱导凋亡的机制研究，并取得了一定的研究成果。
二、HBV PreS2+S/IFN-α融合基因真核表达载体的构建及其表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HBV PreS2+S/IFN-α融合基因真核表达载体的构建及其表达（论文提纲范文）
（1）HBV外膜蛋白结构域的稳定表达及治疗性抗体的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 HBV 的基因结构 |
| 1.2 HBV 前 S2 蛋白的生物学功能 |
| 1.3 HBV 的复制功能 |
| 1.4 HBV 与机体免疫应答的相关性 |
| 1.5 有关 HBV 的临床研究 |
| 1.5.1 前 S2 蛋白与金属硫蛋白的相互作用 |
| 1.5.2 基因表达谱芯片技术的作用 |
| 1.5.3 HBV 中前 S2 蛋白与 HBeAg 的相互作用 |
| 1.5.4 前 S2 蛋白与乙型肝炎疫苗的关系 |
| 1.6 HBV 疫苗的研究现状 |
| 1.7 乙肝疫苗的种类 |
| 1.8 本课题的研究内容及意义 |
| 第2章 HBV/preS1-preS2-HBsAg 真核表达载体的构建及在 293 细胞中的表达 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 基因片段的合成 |
| 2.2.3 琼脂糖凝胶 DNA 目的片段的回收 |
| 2.2.4 目的片段与载体的双酶切 |
| 2.2.5 目的片段与载体的连接 |
| 2.2.6 转化感受态细胞 |
| 2.2.7 挑选阳性克隆并鉴定 |
| 2.2.8 质粒的小量提取 |
| 2.2.9 细胞生物学相关操作 |
| 2.2.10 抗生素的加压筛选 |
| 2.2.11 单克隆细胞筛选 |
| 2.2.12 高表达细胞株的形成 |
| 2.2.13 重组载体质粒在 293 细胞膜蛋白的定位 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Pro-UK-6*His-preS1-preS2-HBsAg(1-6)-HA 基因扩增的 PCR 结果 |
| 2.3.2 酶切鉴定的结果 |
| 2.3.3 测序结果 |
| 2.3.4 稳定表达载体 pcDNA3.1/Pro-UK-6*His-preS1-preS2-HBsAg(1-6)-HA的构建示意图 |
| 2.3.5 细胞转染荧光的检测 |
| 2.3.6 蛋白质免疫印迹的结果 |
| 2.3.7 重组载体质粒在 293 细胞膜蛋白的定位 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 HBV/(preS1-preS2-FC)真核表达载体的构建及在 CHO-K1 细胞中的表达与纯化 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒、菌株 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计与合成 |
| 3.3 分子生物学相关操作 |
| 3.3.1 基因片段的合成 |
| 3.3.2 DNA 目的片段的回收 |
| 3.3.3 目的片段的双酶切 |
| 3.3.4 目的片段与载体的连接 |
| 3.3.5 转化感受态细胞 |
| 3.3.6 挑选阳性克隆并鉴定 |
| 3.3.7 质粒的小量提取 |
| 3.4 细胞生物学相关操作内容 |
| 3.5 有关高效表达单克隆细胞株的筛选 |
| 3.5.1 抗生素的加压筛选 |
| 3.5.2 高效表达细胞株无血清转瓶培养 |
| 3.5.3 亲和层析法纯化目的蛋白 |
| 3.5.4 目的蛋白的浓度和纯度鉴定 |
| 3.5.5 蛋白质免疫印迹法鉴定 |
| 3.6 结果 |
| 3.6.1 重组载体 pcDNA3.1/preS1-preS2-FC 的 PCR 结果 |
| 3.6.2 重组载体 pcDNA3.1/preS1-preS2-a`-FC 的酶切鉴定 |
| 3.6.3 重组载体 pcDNA3.1/preS1-preS2-a`-FC 的测序结果 |
| 3.6.4 最终构建好的载体图 |
| 3.6.5 蛋白质免疫印记的结果 |
| 3.6.6 细胞转染后的检测 |
| 3.6.7 亲和层系纯化结果、蛋白峰 |
| 3.7 讨论 |
| 3.8 小结 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略语词汇表 |
| 附录 A HBV/preS1-preS2-HBsAg 序列设计 |
| 附录 B 表达载体序列测定的结果 |
| 附录 C HBV/(preS1-preS2-FC)序列设计 |
| 附录 D 重组载体 pcDNA3.1/preS1-preS2-a`-FC 的测序结果 |
| 附录 E HBV/(preS1-preS2-FC)蛋白样品等电点检测图 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 |
（2）口服沙门菌递送治疗性HBV-HSP70融合DNA疫苗的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 HBV-HSP70融合DNA疫苗的构建 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 HBV-HSP70融合DNA疫苗真核细胞表达的研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 携带HBV-HSP70融合DNA疫苗的重组减毒沙门菌的构建 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 口服沙门菌递送HBV-HSP70融合DNA疫苗的免疫效果研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（3）C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 核酸疫苗的研究进展 |
| 1.1.1 核酸疫苗的构成 |
| 1.1.1.1 抗原编码基因 |
| 1.1.1.2 真核表达质粒载体 |
| 1.1.2 核酸疫苗的分类 |
| 1.1.3 核酸疫苗可能的作用机制 |
| 1.1.4 核酸疫苗的免疫 |
| 1.1.4.1 靶细胞的选择 |
| 1.1.4.2 接种前动物组织的预处理 |
| 1.1.4.3 核酸疫苗的接种方法和途径 |
| 1.1.4.4 核酸疫苗的接种剂量 |
| 1.1.4.5 核酸疫苗的免疫佐剂选择 |
| 1.1.4.5.1 细胞因子佐剂 |
| 1.1.4.5.2 协同刺激分子佐剂 |
| 1.1.4.5.3 补体佐剂 |
| 1.1.4.5.4 免疫刺激序列( |
| 1.1.4.5.5 霍乱毒素(choleratoxin,CT)和大肠杆菌不耐热肠毒素( |
| 1.1.4.5.6 蛋白转换域( |
| 1.1.4.5.7 模拟或增强 MHC 作用 |
| 1.1.5 核酸疫苗的应用 |
| 1.1.5.1 寄生虫核酸疫苗 |
| 1.1.5.2 细菌核酸疫苗 |
| 1.1.5.3 病毒核酸疫苗 |
| 1.1.6 核酸疫苗研究的意义及展望 |
| 1.2 分子佐剂补体C3d 的研究进展 |
| 1.2.1 补体系统的组成 |
| 1.2.1.1 补体固有成分 |
| 1.2.1.2 补体调节蛋白 |
| 1.2.1.3 补体受体 |
| 1.2.2 补体的激活 |
| 1.2.2.1 经典激活途径 |
| 1.2.2.2 旁路途径 |
| 1.2.2.3 凝集素途径 |
| 1.2.3 C3d 的结构特征及生物学功能 |
| 1.2.3.1 C3d 的产生 |
| 1.2.3.2 C3d 的分子结构 |
| 1.2.3.3 C3d 的天然受体CR2 |
| 1.2.3.4 CR2 与C3d 的结合位点 |
| 1.2.4 C3d 佐剂作用的研究方法 |
| 1.2.4.1 C3d 分子间的直接串联 |
| 1.2.4.2 C3d 与CR2 结合功能区的串联 |
| 1.2.5 C3d 分子的佐剂作用 |
| 1.2.5.1 C3d 对体液免疫应答的影响 |
| 1.2.5.2 C3d 对细胞免疫应答的影响 |
| 1.2.5.3 C3d 对细胞因子表达类型的影响 |
| 1.2.5.4 对抗原特异性体液和细胞免疫的负向调节作用 |
| 1.2.5.5 小鼠品系对C3d 免疫作用的影响 |
| 1.2.6 C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 1.2.6.1 C3d 偶联抗原可增强CR2细胞（B 细胞，FDC 等）对抗原的摄取 |
| 1.2.6.2 促进B 细胞活化，降低B 细胞的活化阈 |
| 1.2.6.3 促进抗体亲合力成熟 |
| 1.2.6.4 上调Raji 细胞协同刺激分子87-1 和87-2 的表达 |
| 1.2.6.5 依赖B 细胞CR2 受体，且相应的抗原必须与C3d 偶联在一起才能发挥作用 |
| 1.2.7 不同动物C3d 的研究 |
| 1.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5 蛋白研究进展 |
| 1.3.1 PRRSV 的结构及其生物学特性 |
| 1.3.1.1 PRRSV 的形态结构 |
| 1.3.1.2 PRRSV 的理化性质 |
| 1.3.1.3 PRRSV 的生物学结构 |
| 1.3.1.4 PRRSV GP5 蛋白 |
| 1.3.2 PRRSV 的免疫特性 |
| 1.3.3 PRRSV 的持续性感染与免疫抑制 |
| 1.3.4 PRRS 的诊断方法研究进展 |
| 1.3.4.1 病毒的分离与鉴定 |
| 1.3.4.2 抗原检测方法 |
| 1.3.4.3 PRRSV 的分子生物学诊断 |
| 1.3.4.4 血清学诊断 |
| 1.3.5 基于GP5 蛋白的疫苗研究进展 |
| 1.3.5.1 核酸疫苗 |
| 1.3.5.2 重组多肽疫苗 |
| 1.3.5.3 活载体疫苗 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株和菌株 |
| 2.1.2 载体 |
| 2.1.3 试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 试验动物 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 溶液及配制 |
| 2.1.7 RT-PCR 相关物品的处理 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 哺乳动物鼠、猪的补体C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 2.2.1.1 鼠、猪C3d 基因的克隆 |
| 2.2.1.2 C3d 和pMD18-T 载体的构建 |
| 2.2.1.3 鼠、猪C3d 基因的测序 |
| 2.2.1.4 哺乳动物与禽类补体C3d 基因序列的比较分析 |
| 2.2.2 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗的构建 |
| 2.2.2.1 鼠、猪C3d-p28 串联体的构建 |
| 2.2.2.2 pcDNA3.1-C3d-p28.n(n=2，4，6)的构建 |
| 2.2.2.3 PRRSV GP5 基因的扩增 |
| 2.2.2.4 pcDNA3.1-GP5-C3d-p28(29).n 重组质粒的构建 |
| 2.2.3 不同动物C3d 分子佐剂对PRRSV GP5 核酸疫苗免疫增强效果研究 |
| 2.2.3.1 重组质粒在Marc145 细胞的表达 |
| 2.2.3.2 GP5 核酸疫苗免疫小鼠效果检测 |
| 2.2.3.3 数据处理和分析 |
| 2.2.4 鼠C3d 分子佐剂沙门氏菌invH 核酸疫苗的构建及免疫效果研究 |
| 2.2.4.1 重组质粒pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.2 4 6 的构建 |
| 2.2.4.2 重组质粒在Marc145 细胞的表达 |
| 2.2.4.3 invH 重组质粒免疫小鼠效果检测 |
| 2.2.4.4 数据处理和分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 哺乳动物鼠、猪的补体C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 3.1.1 鼠、猪C3d 基因克隆的电泳结果 |
| 3.1.2 pMD18-T-C3d 的PCR 及酶切鉴定 |
| 3.1.3 补体C3d cDNA 的测序及序列分析 |
| 3.1.3.1 鼠、猪的C3d 序列 |
| 3.1.3.2 C3d 基因序列比较分析 |
| 3.1.3.3 CR2 结合区氨基酸同源性比较 |
| 3.2 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗的构建 |
| 3.2.1 C3d-p28 串联体的构建 |
| 3.2.1.1 单拷贝C3d-p28 基因克隆 |
| 3.2.1.2 C3d-p28 串联体的构建 |
| 3.2.2 RT-PCR 扩增PRRSV GP5 基因 |
| 3.2.3 pcDNA3.1-GP5-C3d-p28(29).n 重组质粒的构建 |
| 3.3 不同动物C3d 分子佐剂对PRRSV GP5 核酸疫苗免疫增强效果研究 |
| 3.3.1 GP5 表达结果 |
| 3.3.2 安全性检验结果 |
| 3.3.3 GP5 核酸疫苗的免疫效果 |
| 3.3.3.1 抗体水平检测结果 |
| 3.3.3.2 中和抗体测定结果 |
| 3.3.3.3 IFN-γ含量的测定结果 |
| 3.3.3.4 IL-4 含量的测定 |
| 3.4 鼠C3d 分子佐剂沙门氏菌invH 核酸疫苗的构建及免疫效果研究 |
| 3.4.1 pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.n 重组质粒的构建 |
| 3.4.2 invH 表达结果 |
| 3.4.3 安全性检验结果 |
| 3.4.4 invH 核酸疫苗的免疫效果 |
| 3.4.4.1 invH 抗体水平结果 |
| 3.4.4.2 小鼠血清中IL-4 和IFN-γ的含量 |
| 3.4.4.3 小鼠攻毒保护试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 哺乳动物鼠、猪的补体C3d 基因的克隆 |
| 4.2 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗构建 |
| 4.3 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗免疫增强效果研究的意义 |
| 4.4 鼠C3d 沙门氏菌invH 核酸疫苗构建及免疫效果研究的意义 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 博士学位论文内容简介及自评 |
（4）天府肉鹅α干扰素基因克隆、表达及其生物学活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要(ABSTRACT) |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 干扰素的分类及性质 |
| 1.1 Ⅰ型干扰素 |
| 1.2 Ⅱ型干扰素 |
| 1.3 Ⅲ型干扰素 |
| 2 干扰素的分子结构 |
| 3 干扰素的产生 |
| 4 干扰素的作用机制 |
| 4.1 干扰素受体 |
| 4.1.1 Ⅰ型干扰素受体 |
| 4.1.2 Ⅱ型干扰素受体 |
| 4.1.3 IFN-γ受体 |
| 4.2 干扰素的信号传导和效应途径 |
| 4.2.1 干扰素的信号传导 |
| 4.2.1.1 IFN-α/β |
| 4.2.1.2 IFN-γ |
| 4.2.2 效应途径 |
| 4.2.2.1 PKR途径 |
| 4.2.2.2 2'-5'OAS途径 |
| 4.2.2.3 Mx途径 |
| 5 IFN的生物学活性 |
| 5.1 抗病毒繁殖作用 |
| 5.2 抑制细胞分裂增殖、抗肿瘤作用 |
| 5.3 免疫凋节作用 |
| 5.4 免疫佐剂作用 |
| 5.5 干扰素与机体组织系统的相互作用和影响 |
| 5.5.1 干扰素信号的负调控因素 |
| 5.5.1.1 SOCS家族 |
| 5.5.1.2 PIAS家族 |
| 5.5.1.3 PTP家族 |
| 5.5.2 干扰素与神经内分泌系统的相互作用 |
| 5.5.3 病毒对干扰素的抵抗 |
| 5.5.3.1 转录水平的抑制—病毒阻抑干扰素的诱生 |
| 5.5.3.2 病毒对干扰素信号通路的抑制 |
| 5.5.3.3 病毒对干扰素效应蛋白的抑制 |
| 6 家禽α干扰素的研究概况 |
| 7 IFN的基因工程研究及应用 |
| 7.1 IFN的基因工程研究 |
| 7.2 干扰素的应用 |
| 7.3 干扰素临床应用中的副作用问题 |
| 8 α干扰素作为免疫佐剂的研究进展 |
| 9 利用毕赤酵母表达外源蛋白的研究 |
| 9.1 分泌蛋白的翻译后修饰加工 |
| 9.2 影响外源蛋白表达的因素 |
| 第二章 研究目的与意义 |
| 第三章 鹅INF-α基因的克隆及生物信息学分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌种和质粒 |
| 1.3 主要酶和试剂 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 方法设计 |
| 2.2 引物设计 |
| 2.3 天府肉鹅外周血单核细胞的分离培养及细胞总RNA的提取 |
| 2.3.1 天府肉鹅外周血单核细胞的分离培养 |
| 2.3.2 细胞的诱导培养 |
| 2.3.3 细胞总RNA的提取 |
| 2.4 天府肉鹅IFN-α基因的扩增 |
| 2.4.1 RT-PCR反应 |
| 2.4.2 PCR扩增目的片段及检测 |
| 2.4.3 扩增产物的纯化 |
| 2.5 干扰素基因的克隆与测序 |
| 2.5.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.5.2 PCR纯化产物与克隆载体的连接 |
| 2.5.3 连接产物的转化 |
| 2.5.4 阳性重组子的鉴定 |
| 2.5.4.1 质粒的提取 |
| 2.5.4.2 重组质粒pMD18-T-GoIFN-α的双酶切鉴定 |
| 2.5.4.3 重组质粒pMD18-T-GoIFN-α的PCR鉴定 |
| 2.5.5 序列测定 |
| 2.6 天府肉鹅干扰素α的生物信息学分析 |
| 2.6.1 tf-GoIFN-α ORF基因序列分裂 |
| 2.6.2 tf-GoIFN-α基因的密码子使用法特征分析 |
| 2.6.3 信号肽分析 |
| 2.6.4 糖基化位点分析 |
| 2.6.5 跨膜区预测 |
| 2.6.6 磷酸化位点预测 |
| 2.6.7 疏水性分析 |
| 2.6.8 亚细胞定位预测 |
| 2.6.9 抗原表位分析 |
| 3.6.10 二级结构分析 |
| 2.6.11 同源性及进化树分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 天府肉鹅外周血单核细胞诱导培养结果 |
| 3.2 天府肉鹅1FN-α基因PCR扩增 |
| 3.3 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.4 重组质粒的PCR鉴定 |
| 3.5 tf-GoIFN-α基因序列 |
| 3.6 生物信息学分析 |
| 3.6.1 tf-GoIFN-αORF基因序列分析 |
| 3.6.2 tf-GoIFN-α基因的密码子使用法特征分析 |
| 3.6.2.1 不同动物IFN-α基因参数的分析 |
| 3.6.2.2 天府肉鹅IFN-α基因密码子使用频率 |
| 3.6.3 信号肽分析 |
| 3.6.4 糖基化位点分析 |
| 3.6.5 跨膜区预测 |
| 3.6.6 磷酸化位点预测 |
| 3.6.7 疏水性分析 |
| 3.6.8 抗原表位分析 |
| 3.6.9 亚细胞定位预测 |
| 3.6.10 二级结构分析 |
| 3.6.11 同源性及进化树分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 天府肉鹅IFN-α的诱导和产生 |
| 4.2 RNA的提取及基因扩增 |
| 4.3 天府肉鹅IFN-α基因的生物信息学分析 |
| 4.4 天府肉鹅IFN-α基因的密码子特征 |
| 5 小结 |
| 第四章 天府肉鹅IFN-α成熟肽基因的原核表达及抗病毒活性研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌种、质粒及毒株 |
| 1.3 主要酶和试剂 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 天府肉鹅IFN-α成熟肽基因原核表达载体的构建 |
| 2.1.1 引物设计 |
| 2.1.2 成熟肽基因的扩增 |
| 2.1.3 成熟肽基因的克隆 |
| 2.1.4 pMD18-T-mGoIFN-α和pET-32a(+)质粒的提取 |
| 2.1.5 质粒DNA的酶切和回收 |
| 2.1.6 目的基因(mGoIFN-α)和表达载体pET-32a(+)的连接 |
| 2.1.7 重组质粒的转化 |
| 2.1.8 重组质粒的鉴定 |
| 2.1.8.1 PCR鉴定 |
| 2.1.8.2 酶切鉴定 |
| 2.1.8.3 原核表达质粒的序列测定 |
| 2.2 重组蛋白的表达 |
| 2.2.1 Rosetta感受态细胞的制备 |
| 2.2.2 工程菌的诱导表达 |
| 2.2.3 诱导表达重组蛋白的条件优化 |
| 2.2.4 重组蛋白的纯化和复性 |
| 2.2.4.1 包涵体的制备 |
| 2.2.4.2 包涵体的洗涤 |
| 2.2.4.3 包涵体的溶解 |
| 2.2.4.4 透析复性 |
| 2.2.4.5 Ni-IMAC纯化复性 |
| 2.2.4.6 蛋白浓度的测定 |
| 2.3 高免血清的制备 |
| 2.3.1 蛋白疫苗的制备 |
| 2.3.2 动物免疫 |
| 2.3.3 高免血清效价检测 |
| 2.3.4 Western Blot检测 |
| 2.4 重组天府肉鹅α干扰素的抗病毒活性研究 |
| 2.4.1 天府肉鹅IFN-α抗VSV活性研究 |
| 2.4.1.1 VSV的扩增与保存 |
| 2.4.1.2 原代鹅胚成纤维细胞的制备和培养 |
| 2.4.1.3 VSV半数细胞感染量(TCID50)测定 |
| 2.4.1.4 重组天府肉鹅IFN-α抗VSV活性的测定 |
| 2.4.2 重组天府肉鹅IFN-α抗GPV的研究 |
| 2.4.2.1 GPV的接种、收获与毒价测定 |
| 2.4.2.2 荧光定量PCR检测重组天府肉鹅IFN-α抗GPV的研究 |
| 2.4.2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.4.2.2.2 标准阳性模板的制备 |
| 2.4.2.2.3 引物合理性验证及反应条件的优化 |
| 2.4.2.2.4 标准曲线制备 |
| 2.4.2.2.5 试验样品的制备 |
| 2.4.2.2.5.1 试验分组 |
| 2.4.2.2.5.2 样品制备 |
| 2.4.2.2.6 定量PCR检测 |
| 2.4.2.2.7 结果计算 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 天府肉鹅IFN-α成熟蛋白基因片段的克隆 |
| 3.2 天府肉鹅IFN-α成熟肽基因原核表达载体的构建 |
| 3.3 重组蛋白的原核表达 |
| 3.3.1 诱导时间的优化 |
| 3.3.2 IPTG诱导浓度的优化 |
| 3.3.3 天府肉鹅IFN-α成熟肽基因重组蛋白复性 |
| 3.4 高免血清效价测定 |
| 3.5 免疫兔血清的Western Blot检测 |
| 3.6 重组天府肉鹅α干扰素成熟蛋白的抗病毒活性研究 |
| 3.6.1 重组天府肉鹅IFN-α抗VSV活性研究 |
| 3.6.2 SYBR Green real-time PCR检测重组天府肉鹅IFN-α抗GPV的研究 |
| 3.6.2.1 反应条件的优化 |
| 3.6.2.2 标准曲线的建立 |
| 3.6.2.3 溶解曲线分析 |
| 3.6.2.4 SYBR Green real-time PCR检测鹅IFN-α抗GPV活性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于信号肽及成熟蛋白基因表达 |
| 4.2 关于蛋白的复性 |
| 4.3 鹅IFN-α重组蛋白抗VSV活性 |
| 4.4 SYBR Green real-time PCR测鹅IFN-α抗GPV活性 |
| 5 小结 |
| 第五章 鹅IgG的提取纯化及兔抗鹅IgG酶标抗体的制备 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物\毒株 |
| 1.2 主要酶和试剂 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 兔抗鹅IFN-α基因蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.1.1 实验动物准备 |
| 2.1.2 鹅卵黄IgG的提纯 |
| 2.1.3 鹅卵黄IgG的鉴定 |
| 2.1.4 蛋白含量的测定 |
| 2.1.5 蛋白疫苗的制备 |
| 2.1.6 动物免疫 |
| 2.1.7 血清的分离 |
| 2.1.8 兔抗鹅IgG效价的测定 |
| 2.1.9 兔血清IgG的纯化 |
| 2.1.9.1 用辛酸-硫酸铵法粗提血清IgG |
| 2.1.9.2 DEAEA-50纤维柱层析纯化兔抗鹅血清IgG |
| 2.1.9.2.1 纤维素平衡 |
| 2.1.9.2.2 离子交换层析纯化IgG |
| 2.2 兔抗鹅IgG酶标抗体的制备 |
| 2.2.1 兔抗鹅辣根过氧化物(HRP)酶标抗体的制备 |
| 2.2.2 ELISA抗原的制备 |
| 2.2.3 间接ELISA操作方法 |
| 2.2.4 抗原最适浓度和最适鹅血清稀释度的确定 |
| 2.2.5 酶标抗体稀释度的选择 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 免疫扩散试验 |
| 3.2 抗体纯化检测 |
| 3.4 抗原包被浓度和鹅血清稀释度的确定 |
| 3.5 HRP酶标兔抗鹅二抗工作浓度的确定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于血清IgG的纯化 |
| 4.2 关于ELISA条件的优化 |
| 4.3 关于酶标二抗 |
| 5 小结 |
| 第六章 天府肉鹅IFN-α真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的瞬时表达 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌种和质粒 |
| 1.3 主要酶和试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 天府肉鹅α干扰素真核表达质粒的构建 |
| 2.1.1 菌种的培养 |
| 2.1.2 pMD-18-T-GoIFN-α质粒的提取 |
| 2.1.3 目的基因的准备 |
| 2.1.4 pcDNA3.1(+)的线性化 |
| 2.1.5 pcDNA3.1(+)的去磷酸化 |
| 2.1.6 连接反应 |
| 2.1.7 重组质粒的转化 |
| 2.1.8 重组质粒的鉴定 |
| 2.1.8.1 PCR鉴定 |
| 2.1.8.2 酶切鉴定 |
| 2.1.8.3 真核表达质粒的序列测定 |
| 2.2 pcDNA3.1-GoIFN-α在COS-7细胞中的瞬时表达 |
| 2.2.1 重组质粒pcDNA3.1-GoIFN-α转染COS-7细胞 |
| 2.2.1.1 真核表达质粒pcDNA3.1-goIFN-α的提取 |
| 2.2.1.2 COS-7细胞的准备 |
| 2.2.1.2.1 COS-7细胞复苏 |
| 2.2.1.2.2 转染前COS-7细胞的处理 |
| 2.2.1.3 脂质体法转染COS-7细胞 |
| 2.2.2 间接免疫荧光法检测pcDNA3.1-GoIFN-α的表达 |
| 2.2.3 ELISA法鉴定目的蛋白的分泌 |
| 2.2.4 Westem blot分析 |
| 2.3 pcDNA3.1-GoIFN-α生物活性的测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鹅α干扰素真核表达质粒的构建 |
| 3.2 GoIFN-α基因表达产物在COS-7细胞中的定位 |
| 3.3 GoIFN-α基因表达产物在细胞上清液中的检测 |
| 3.4 Westem-blot分析 |
| 3.5 基因表达产物GoIFN-α抗病毒检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 GoIFN-α外源蛋白在COS-7细胞中的表达 |
| 4.2 抗病毒活性的检测 |
| 5 小结 |
| 第七章 天府肉鹅IFN-α真核表达质粒的免疫佐剂效应 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌种、质粒和毒株 |
| 1.3 主要酶和试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 分子佐剂和小鹅瘟VP3基因疫苗大量制备和纯化 |
| 2.1.1 碱裂解法提取质粒,大量制备基因疫苗及佐剂 |
| 2.1.2 聚乙二醇法(PEG-8000)纯化基因疫苗及佐剂质粒 |
| 2.2 动物分组和免疫 |
| 2.3 血样的采集和处理 |
| 2.4 淋巴细胞转化试验 |
| 2.4.1 外周血淋巴细胞的分离 |
| 2.4.2 淋巴细胞的诱导培养 |
| 2.4.3 检测及数据处理 |
| 2.5 血清IgG的变化 |
| 2.5.1 ELISA抗原的制备 |
| 2.5.2 血清抗体IgG检测 |
| 2.5.3 结果分析 |
| 2.6 中和抗体水平的检测 |
| 2.6.1 小鹅瘟强毒的培养 |
| 2.6.2 抗体水平检测 |
| 2.6.3 计算中和指数 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和佐剂后淋巴细胞增殖试验检测结果 |
| 3.1.1 鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和不同剂量的佐剂后淋巴细胞增殖试验检测结果 |
| 3.1.2 鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和不同佐剂后淋巴细胞增殖试验检测结果 |
| 3.1.3 鹅免疫GPV-VP3基因疫苗及佐剂后淋巴细胞增殖试验检测结果 |
| 3.2 间接ELISA检测鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和佐剂后的IgG动态变化结果 |
| 3.2.1 间接ELISA检测鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和不同剂量佐剂后的IgG动态变化 |
| 3.2.2 间接ELISA检测鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和不同佐剂后的IgG动态变化 |
| 3.2.3 间接ELISA检测鹅免疫GPV-VP3基因疫苗和佐剂后的IgG动态变化 |
| 3.3 小鹅瘟强毒TCID_(50)的测定 |
| 3.4 中和抗体试验检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于细胞免疫和淋巴细胞体外增殖的关系 |
| 4.2 关于IFN-α的分子免疫佐剂功能 |
| 5 小结 |
| 第八章 天府肉鹅α干扰素基因在毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒活性研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 菌种、质粒和病毒 |
| 1.2 主要酶和试剂 |
| 1.3 主要试剂配制 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 天府肉鹅α干扰素成熟肽基因的克隆 |
| 2.1.1 引物设计及合成 |
| 2.1.2 基因扩增 |
| 2.1.3 成熟肽基因的克隆 |
| 2.2 酵母表达载体的构建 |
| 2.2.1 pMD18-T-m2GoIFN-α和pPICZαA质粒的提取 |
| 2.2.2 质粒DNA的酶切和回收 |
| 2.2.3 目的基因(mGoIFN-α)与表达载体pPICZαA的连接 |
| 2.2.4 连接产物的转化 |
| 2.2.5 酵母表达载体的鉴定 |
| 2.2.5.1 PCR鉴定 |
| 2.2.5.2 酶切鉴定 |
| 2.2.5.3 酵母表达载体的序列测定 |
| 2.3 天府肉鹅IFN-α在毕赤酵母中的表达 |
| 2.3.1 重组酵母的构建 |
| 2.3.1.1 空载体pPICZαA及表达载体pPICZαA-GoIFN-α的线性化 |
| 2.3.1.1.1 SacⅠ单酶切 |
| 2.3.1.1.2 线性化质粒的纯化 |
| 2.3.1.2 受体菌X-33感受态细胞的制备 |
| 2.3.1.3 酵母菌的电转化 |
| 2.3.1.3.1 电转仪参数的设置 |
| 2.3.1.3.2 电转化操作 |
| 2.3.1.4 重组鹅α干扰素基因酵母菌株的鉴定 |
| 2.3.1.4.1 重组酵母基因组DNA的提取 |
| 2.3.1.4.2 PCR鉴定 |
| 2.3.2 重组酵母菌株的诱导表达 |
| 2.3.2.1 Mut+型重组酵母菌株的初步表达 |
| 2.3.2.2 高拷贝重组酵母菌株的筛选 |
| 2.3.2.3 重组酵母菌株的表达条件的优化 |
| 2.3.2.3.1 诱导表达时间的优化 |
| 2.3.2.3.2 甲醇浓度的优化 |
| 2.3.2.3.3 双抗体夹心ELISA检测表达条件的优化 |
| 2.3.3 重组酵母表达产物的SDS-PAGE和Western-blot分析 |
| 2.3.3.1 配制SDS-PAGE凝胶 |
| 2.3.3.2 SDS-PAGE |
| 2.3.3.3 表达产物的Western-blot分析 |
| 2.4 重组天府肉鹅α干扰素抗病毒活性检测 |
| 2.4.1 酵母表达产物的纯化 |
| 2.4.1.1 透析袋的预先处理 |
| 2.4.1.2 重组IFN-α的纯化 |
| 2.4.2 抗病毒活性检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 成熟肽基因的克隆 |
| 3.2 酵母表达载体的构建 |
| 3.3 酵母转化子的鉴定 |
| 3.4 斑点法筛选高表达菌株 |
| 3.5 诱导表达条件的优化 |
| 3.6 表达产物的SDS-PAGE |
| 3.7 Western-blot检测 |
| 3.8 重组天府肉鹅IFN-α酵母表达产物的抗病毒活性检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于表达系统的选择 |
| 4.2 关于毕赤酵母转化方法的选取 |
| 4.3 关于酵母表达的糖基化 |
| 4.4 天府肉鹅α干扰素酵母表达产物的抗病毒活性 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间文章完成情况 |
（5）畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 DNA 疫苗及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 综述一 DNA 疫苗的研究进展及其免疫应答增强策略 |
| （一） DNA 疫苗的研究进展 |
| 1、核酸疫苗的研究历史 |
| 2、核酸疫苗的组成和分类 |
| 2.1 核酸疫苗的组成 |
| 2.2 核酸疫苗的分类 |
| 3、DNA 疫苗的免疫机制 |
| 4、核酸疫苗的优点及其不足 |
| 4.1 核酸疫苗的优点 |
| 4.2 核酸疫苗的不足 |
| 5、影响DNA 免疫效果的主要因素 |
| 5.1 目的基因的选择 |
| 5.2 载体及启动子的选择 |
| 5.3 增强剂和佐剂的应用 |
| 5.4 接种途径和剂量 |
| 5.5 接种前动物组织的预处理 |
| （二） DNA 疫苗免疫应答增强策略 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 1.1 细胞因子基因佐剂 |
| 1.2 共刺激分子 |
| 1.3 补体佐剂 |
| 1.4 免疫刺激序列（immunostimulation sequence，ISS） |
| 1.5 霍乱毒素（choleratoxin，CT）和大肠杆菌不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT） |
| 1.6 蛋白转换域（protein transduction domains，PTD） |
| 1.7 模拟或增强MHC 作用 |
| 1.8 提高APC 存活时间和捕捉处理抗原的能力 |
| 1.9 提高抗原处理能力 |
| 1.10 双作用子的应用 |
| 2、通过基因修饰改变抗原特性以提高其免疫原性 |
| 3、载体的优化及选择 |
| 3.1 质粒载体 |
| 3.2 细菌载体 |
| 3.3 病毒载体 |
| 4、免疫方案的优化 |
| 4.1 免疫途径 |
| 4.2 免疫工具的选择 |
| 4.3 免疫程序及组合免疫 |
| 5、展望 |
| 综述二 补体系统概述及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| （三） 补体系统概述 |
| 1、补体成分的分类 |
| 1.1 补体系统的固有成分 |
| 1.2 补体系统的调节因子 |
| 1.3 补体受体 |
| 1.4 补体活性片段 |
| 2、补体系统的激活 |
| 2.1 经典激活途径 |
| 2.2 替代途径 |
| 2.3 凝集素途径 |
| （四） CR2-C3d 的结构特征及生物学功能 |
| 1、分子特征 |
| 1.1 C3d 分子 |
| 1.2 CR2(CD21 分子) |
| 1.3 CR2-C3d 结合的结构特征 |
| 2、C3d-CR2 结合介导的生物学效应及作用机理 |
| 2.1 C3d-CR2 结合介导、增强B 细胞Ag 的内化、提呈 |
| 2.2 C3d-CR2 结合促进B 细胞活化及分化 |
| 2.3 C3d-CR2 结合促进记忆性B 细胞的产生 |
| （五） C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 2、C3d 的分子结构 |
| 3、C3d 分子的佐剂作用 |
| 3.1 C3d 可提高抗流感病毒、抗麻疹病毒HA 抗体的水平 |
| 3.2 C3d 可以增强基因免疫效果 |
| 3.3 C3d 可促进抗HIV-1 衣壳蛋白抗体的生成 |
| 3.4 C3d-P28 可在提高体液免疫应答的同时增强基因免疫诱导的HBV 特异性细胞免疫应答 |
| 3.5 C3d 可增强PPS514 的免疫原性、促进Ig 类别转换 |
| 3.6 C3d 负调控HER-2/neu 基因免疫诱导的免疫应答 |
| 3.7 C3d 增强hCGβ的免疫原性、转变免疫应答 |
| 3.8 C3d 与靶抗原共表达的免疫抑制效应 |
| 4、C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 4.1 C3d 偶联抗原可增强CR~(2+)细胞（B 细胞，FDC 等）对抗原的摄取 |
| 4.2 C3d/C3dg 包裹的抗原被 BCR 特异性识别产生抗原刺激信号,同时又与 B 细胞表面的CR2 结合形成交联桥，提供共刺激活化信号，促进B 细胞活化，降低B细胞的活化阈 |
| 4.3 C3d 通过结合CR2、上调IL-4 和转录因子的表达、促进抗体亲合力成熟来增强基因免疫诱导的HBV 特异性免疫应答 |
| 4.4 分子佐剂C3d 上调Raji 细胞协同刺激分子B7-1 和B7-2 的表达 |
| 4.5 C3d 的佐剂作用依赖B 细胞CR2 受体，且相应的抗原必须与C3d 偶联在一起才能发挥作用 |
| （六） 本研究的目的及意义 |
| 第二部分 试验研究部分 |
| 一 不同畜禽补体C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 载体 |
| 1.1.3 试剂及试剂盒 |
| 1.1.4 试验动物 |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.1.6 试验所用溶液及其配制 |
| 1.1.7 RT-PCR 相关物品的处理 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 引物设计 |
| 1.2.3 RT- PCR 扩增C3d cDNA |
| 1.2.4 制作感受态细胞 |
| 1.2.5 PCR 产物与pMD18-T 的连接 |
| 1.2.6 连接物的转化 |
| 1.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 1.2.8 测序 |
| 1.2.9 补体C3d 基因序列分析 |
| 1.2.10 补体C3d 基因蛋白质结构分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR 扩增C3d cDNA |
| 2.2 pMD18-T-C3d 的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 补体C3d cDNA 的测序及序列分析 |
| 2.3.1 测序结果递交GenBank |
| 2.3.2 利用DNASTAR 软件进行C3d 基因序列比较分析 |
| 2.3.3 DNAMAN 及Vector NTI 软件进行CR2 结合区氨基酸同源性比较 |
| 2.4 蛋白序列结构及功能特征预测 |
| 2.4.1 ProtParam tool 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行理化性质分析 |
| 2.4.2 ProtFun 2.2 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行蛋白功能推测分析 |
| 2.4.3 补体C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测分析 |
| 2.4.4 补体C3d 基因编码的蛋白质三级结构预测分析 |
| 3 讨论 |
| 二 鸡补体C3d 原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体与受体菌 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂 |
| 1.1.5 包涵体纯化的有关试剂 |
| 1.1.6 免疫转印有关试剂和材料 |
| 1.1.7 仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鸡肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 RT-PCR 及C3d cDNA 的克隆、测序 |
| 1.2.3 C3d 原核表达载体的构建 |
| 1.2.4 重组质粒的提取与初步筛选 |
| 1.2.5 pET-C3d 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 1.2.6 重组菌表达条件的优化 |
| 1.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 1.2.8 表达产物的Western-blotting 检测 |
| 1.2.9 重组表达蛋白的纯化 |
| 2 结果 |
| 2.1 C3d cDNA 的克隆及其PCR、酶切鉴定 |
| 2.2 pET-32a-C3d 表达载体的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 重组蛋白的表达 |
| 2.4 IPTG 诱导表达最佳浓度的确定 |
| 2.5 IPTG 诱导表达最佳作用时间的确定 |
| 2.6 目的蛋白的表达量分析 |
| 2.7 Western-Blotting 结果 |
| 2.8 融合蛋白的纯化 |
| 2.8.1 硫酸铵盐析 |
| 2.8.2 Sephadex G-200 凝胶过滤层析 |
| 2.8.3 蛋白质纯度的鉴定 |
| 2.8.4 蛋白浓度的测定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 重组C3d 原核表达系统的选择 |
| 3.2 重组C3d 目的蛋白的表达 |
| 3.3 重组C3d 目的蛋白的复性 |
| 3.4 重组C3d 目的蛋白的检测鉴定 |
| 3.5 重组C3d 目的蛋白的分离提纯 |
| 三 鸡补体C3d 重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗C3d 21 肽抗体 |
| 1.1.2 SPF 鸡血清及SPF 鸡 |
| 1.1.3 菌株 |
| 1.1.4 新西兰白兔 |
| 1.1.5 1%致敏绵羊红细胞 |
| 1.1.6 主要试剂 |
| 1.2 C3d 佐剂大肠杆菌疫苗的制备 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的分离纯化 |
| 1.2.2 大肠杆菌抗原的制备 |
| 1.2.3 C3d 与大肠杆菌抗原的连接 |
| 1.3 C3d 佐剂疫苗的作用效果试验 |
| 1.3.1 动物试验免疫方案 |
| 1.3.2 抗体效价的检测（间接ELISA 方法） |
| 1.3.3 总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 2 结果 |
| 2.1 不同佐剂疫苗的效果比较 |
| 2.2 疫苗注射对补体总活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 四 鸡补体C3d 重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 新城疫油乳剂灭活苗 |
| 1.1.2 重组C3d 佐剂新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.3 血清和抗原 |
| 1.1.4 攻毒用新城疫病毒 |
| 1.1.5 实验用鸡 |
| 1.1.6 主要试剂及其配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的纯化制备 |
| 1.2.2 试验动物分组免疫及样品采集 |
| 1.2.3 血清HI 抗体的检测 |
| 1.2.4 淋巴细胞增殖试验（MTT 法） |
| 1.2.5 攻毒保护试验 |
| 1.2.6 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 三组试验鸡在免疫接种后不同时期HI 抗体的检测结果 |
| 2.2 三组试验鸡在免疫接种后不同时期法氏囊B 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.3 三组试验鸡在免疫接种后不同时期胸腺T 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.4 攻毒保护试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 C3d 分子佐剂与淋巴细胞增值试验（MTT 法） |
| 3.2 重组C3d 蛋白和灭活油乳苗的免疫协同作用 |
| 3.3 重组C3d 分子佐剂研究意义及现状 |
| 五 鸡补体C3d-p29 多聚体与新城疫 F 基因真核表达重组质粒的构建及其表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料及仪器设备 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 P29 串联体的构建 |
| 1.2.2 pcDNA-P29.n(n=2，4，6)的构建 |
| 1.2.3 RT-PCR 扩增新城疫(F48E9 株)F 基因 |
| 1.2.4 插入抗原基因 |
| 1.2.5 重组真核表达质粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF) |
| 2 结果 |
| 2.1 新城疫C3d-P29 分子佐剂F 基因疫苗的构建 |
| 2.2 构建P29 串联体 |
| 2.2.1 单拷贝P29 基因克隆 |
| 2.2.2 P29 串联体的构建 |
| 2.3 RT-PCR 扩增新城疫F48E9 株F 基因 |
| 2.4 抗原基因的插入 |
| 2.5 转染细胞中pcDNA-F-C3d-P29.n F 表达蛋白的检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DNA 疫苗佐剂研究的意义 |
| 3.2 抗原基因的选择及C3d-P29 多聚体的构建 |
| 3.3 脂质体及影响其转染CEF 细胞的因素 |
| 六 鸡C3d-P29 重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3 含量的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 试验动物分组及免疫注射 |
| 1.2.2 不同试验组鸡血清补体总活性的测定 |
| 1.2.3 各试验组鸡血清中总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 1.2.4 抗鸡C3 21 肽抗体的制备 |
| 1.2.5 抗鸡C3 21 肽抗体工作浓度的确定 |
| 1.2.6 C3 含量标准曲线的绘制 |
| 1.2.7 各试验组鸡血清补体C3 含量的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 各试验组鸡血清中补体总活性 |
| 2.1.1 溶血素效价的测定 |
| 2.1.2 各试验组鸡血清中补体总活性的测定 |
| 2.2 兔抗鸡C3 21 肽IgG 抗体工作浓度的确定 |
| 2.3 溶液中C3 含量与OD 值关系的标准曲线 |
| 2.4 各试验组鸡血清中补体C3 的含量、 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 微量板溶血法测定动物血清补体的效价 |
| 3.2 影响补体效价测定的因素 |
| 3.3 补体总活性与动物的抗病力 |
| 3.4 C3 21 肽的合成及抗C3 21 肽抗体的制备 |
| 3.5 补体C3 与动物的抗病力 |
| 七 新城疫补体C3d 分子佐剂疫苗免疫效果的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 常用试剂配制 |
| 1.1.2 制备新城疫油乳剂灭活苗用佐剂 |
| 1.1.3 新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.4 ELISA 常用试剂 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组质粒的大量提取 |
| 1.2.2 质粒的安全性检验 |
| 1.2.3 质粒疫苗的体液免疫效果检测 |
| 1.2.4 攻毒保护试验 |
| 1.2.5 病毒排放的检测 |
| 1.2.6 解剖检查 |
| 1.2.7 重组质粒疫苗的细胞免疫效果检测 |
| 1.2.8 重组鸡补体C3d 质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d 蛋白（rChC3d）对外周血T 淋巴细胞增殖效果对比试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 安全性检验结果 |
| 2.2 血凝抑制抗体变化 |
| 2.3 间接ELISA 法检测NDV 抗体最佳工作浓度的确定结果 |
| 2.4 NDV 核酸疫苗在SPF 雏鸡体内诱导抗体的检测结果 |
| 2.5 攻毒保护试验结果 |
| 2.6 免疫鸡攻毒后的病毒分离结果 |
| 2.7 重组质粒疫苗细胞免疫效果的检测结果 |
| 2.8 pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6 与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 新城疫核酸疫苗研究的意义 |
| 3.2 疫苗注射部位、注射方式和免疫剂量的选择 |
| 3.3 采用淋巴细胞转化试验（MTT 法）进行外周血T 淋巴细胞增殖实验效果的讨论 |
| 3.4 本源动物补体C3d 及抗原基因的选择 |
| 3.5 C3d 的CR2 结合域P29 的特殊性 |
| 3.6 C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测 |
| 附录二 使用garnier 软件对C3d 二级结构预测结果 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
（6）融合基因S2S/IFNα对小鼠免疫反应的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 动物和靶细胞 |
| 1.2 质粒与试剂 |
| 1.3 重组质粒的大量制备和纯化 |
| 1.4 动物分组及免疫接种 |
| 1.5 免疫小鼠抗体水平检测 |
| 1.6 免疫小鼠脾细胞CTL杀伤功能检测 |
| 1.7 增殖性分析 |
| 1.8 细胞因子的ELISA分析 |
| 1.9 免疫脾细胞CD25表达量的检测 |
| 1.10 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 各组小鼠免疫后血清抗-HBs抗体水平的检测 |
| 2.2 各组免疫小鼠CTL杀伤功能的检测 |
| 2.3 各组免疫小鼠的培养脾细胞增殖性分析结果 |
| 2.4 各组小鼠免疫后细胞因子的检测结果 |
| 2.5 各组小鼠培养脾细胞表面CD25的检测结果 |
| 3 讨论 |
（7）DHBV侵染规律和preS蛋白原核表达及在评价抗人类乙肝新药的应用（论文提纲范文）
| 本研究的创新点 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 鸭乙型肝炎病毒的研究进展 |
| 1 DHBV生物学特性 |
| 1.1 包膜蛋白 |
| 1.2 核蛋白 |
| 1.3 P蛋白 |
| 1.4 X抗原 |
| 2 DHBV感染鸭原代肝细胞模型 |
| 2.1 DHBV感染鸭原代肝细胞模型的建立 |
| 2.2 DHBV感染鸭原代肝细胞模型的应用 |
| 3 DHBV感染鸭动物模型 |
| 3.1 DHBV感染动物模型的建立 |
| 3.2 DHBV感染动物模型的影响因素 |
| 4 DHBV感染动物模型的相关研究及应用 |
| 4.1 DHBV感染鸭的各种动物模型 |
| 4.2 DHBV突变株的生物学意义 |
| 4.3 抗HBV药物筛选模型 |
| 4.4 液制品消毒学领域的应用 |
| 5 小结 |
| 5.1 存在的问题 |
| 5.2 展望 |
| 第二章 病毒功能性蛋白的原核表达及其应用的研究进展 |
| 1 概述 |
| 2 病毒功能性蛋白表达采用的原核表达系统 |
| 2.1 原核表达系统 |
| 2.2 外源基因在大肠杆菌细胞中的表达 |
| 2.3 影响克隆基因在大肠杆菌细胞中表达效率的因素 |
| 3 病毒功能性基因的原核表达 |
| 3.1 嗜肝DNA病毒的原核表达 |
| 3.2 鸭乙型肝炎病毒preS蛋白的功能及其原核表达 |
| 4 应用前景 |
| 4.1 preS蛋白的功能研究 |
| 4.2 preS抗原的诊断及预后作用 |
| 4.3 preS抗原与疫苗 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第三章 DHBV阳性血清的分离、全基因组的克隆及序列分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 菌株及质粒 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 阳性血清的分离 |
| 2.2 DHBV全基因组的克隆 |
| 3 试验结果 |
| 3.1 血清DHBV-DNA的分离 |
| 3.2 DHBV全基因序列扩增和克隆 |
| 3.3 四川麻鸭DHBV全基因测序结果 |
| 3.4 四川麻鸭DHBV全基因序列分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 DHBV PRES基因表达质粒的构建与表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及表达载体 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 常用材料与试剂 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 仪器与设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 扩增目的基因的引物设计 |
| 2.2 PCR扩增目的基因 |
| 2.3 PCR产物的鉴定 |
| 2.4 原核表达质粒的构建 |
| 2.5 转化表达菌株BL21 |
| 2.6 诱导表达 |
| 2.7 表达产物的SDS-PAGE分析 |
| 2.8 Western blotting检测 |
| 2.9 表达蛋白的可溶性和不可溶性分析 |
| 2.10 表达条件的优化 |
| 2.11 重组蛋白的大量诱导表达 |
| 2.12 Ni—NTA亲和层析纯化重组蛋白的纯化 |
| 2.13 纯化蛋白的应用 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.2 T载体克隆及测序鉴定 |
| 3.3 原核表达质粒的构建及鉴定 |
| 3.4 诱导表达 |
| 3.5 可溶性分析 |
| 3.6 免疫印迹 |
| 3.7 表达条件的优化 |
| 3.8 重组蛋白的纯化 |
| 3.9 SDS-PAGE分析纯化蛋白 |
| 3.10 纯化蛋白的应用 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 基于鸭乙型肝炎病毒PRES蛋白免疫组化方法建立及其病毒感染鸭的抗原定位 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的复制 |
| 2.2 雏鸭人工感染DHBV标本采集 |
| 2.3 免疫组化检测DHBV方法的建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫组化方法的建立 |
| 3.2 免疫组化检测各组织器官的定位研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 免疫组化方法检测DHBsAg的建立 |
| 4.2 免疫组化方法检测DHBsAg建立的意义 |
| 4.3 免疫组化方法对DHBsAg的定位研究 |
| 5 小结 |
| 第六章 实时荧光定量PCR检测鸭乙型肝炎病毒方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验毒株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 标准品的制备 |
| 2.2 待检标本的来源 |
| 2.3 FQ-PCR条件的建立和优化 |
| 2.4 FQ-PCR的敏感性检测 |
| 2.5 FQ-PCR的特异性检测 |
| 2.6 FQ-PCR的可重复性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 反应体系的优化 |
| 3.2 荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 3.3 荧光定量PCR稳定性和重复性试验 |
| 3.4 荧光定量PCR特异性试验 |
| 3.5 荧光定量PCR敏感性试验 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第七章 鸭乙型肝炎病毒在感染鸭体内侵染规律 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验毒株 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的复制 |
| 2.2 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的病理组织学研究 |
| 2.3 DHBV在感染鸭体内的侵染和分布规律 |
| 2.4 雏鸭人工感染DHBV疾病模型的血液生化指标的研究 |
| 3 结果 |
| 3.1 病理组织学变化 |
| 3.2 免疫组化检测各组织器官的变化规律 |
| 3.3 DHBV-DNA在血清和肝组织中的变化规律 |
| 3.4 血液病理学变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 雏鸭人工感染DHBV后在体内的侵染规律及其意义 |
| 4.2 DHBV感染发病机理探讨 |
| 4.3 病理组织学和血液生化指标变化规律 |
| 5 小结 |
| 第八章 免疫组化、FQ-PCR和鸭乙型肝炎病毒感染模型联合评价抗人类乙肝新药的实验研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 供试药物 |
| 1.2 常用材料与试剂 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 1.4 试剂配制 |
| 2 体外实验方法 |
| 2.1 细胞株 |
| 2.2 HepG2 2.2.15细胞的传代与培养 |
| 2.3 细胞毒性试验 |
| 2.4 对细胞分泌(上清)的HBsAg、HBeAg的抑制试验 |
| 2.5 上清病毒基因组DNA的分离及定量检测 |
| 2.6 细胞总DNA的提取及定量检测 |
| 3 体内实验方法 |
| 3.1 毒株 |
| 3.2 主要试剂 |
| 3.3 实验动物及分组 |
| 3.4 鸭肝组织标本形态学观察 |
| 4 结果 |
| 4.1 受试药物对HepG 2.2.15细胞毒性作用结果 |
| 4.2 受试化合物细胞水平药效学研究结果 |
| 4.3 FQ-PCR检测血清和肝组织中DHBV-DNA的结果 |
| 4.4 病理学检查结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻博期间发表的论文 |
（9）RNA复制子对基因表达的促进作用及动物促生长方法的探讨（论文提纲范文）
| 提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 甲病毒载体系统的研究进展 |
| 1 甲病毒简介 |
| 2 甲病毒复制子载体发展历程 |
| 3 甲病毒复制子结构以及递送方式 |
| 4 甲病毒复制子载体种类 |
| 5 甲病毒复制子载体应用 |
| 6 甲病毒复制子载体的生物安全性问题 |
| 第二章 生长激素释放因子和生长激素释放抑制因子 |
| 1 GHRH、SS 与GH/IGF-I 生长轴的关系 |
| 2 GHRH 概述 |
| 3 SS 概述 |
| 4 GHRH 和SS 共同协调控制GH 的分泌模式 |
| 5 GHRH 在动物生产中的应用研究 |
| 6 SS 在动物生产中的应用研究 |
| 7 GHRH 和SS 基因转移的新方法：PLGA-MP |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 GHRH、SS 及GHRH-SS RNA 复制子真核表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 GHRH 基因RNA 复制子真核表达载体的构建 |
| 2.2 HBSAG-SS 基因RNA 复制子真核表达载体的构建 |
| 2.3 GHRH-HBSAG-SS 双基因RNA 复制子真核表达载体的构建 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 GHRH、SS 及GHRH-SS RNA 复制子表达载体在真核细胞中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 总RNA 的提取 |
| 2.2 转染细胞的RT-PCR |
| 2.3 TRICINE-SDS-PAGE 和SDS-PAGE 结果 |
| 2.4 表达产物的DOT-ELISA（检测表达的SS 和GHRH） |
| 2.5 WESTERN BLOT 检测结果（检测表达的HBSAG、SS、 |
| 2.6 细胞原位免疫荧光结果 |
| 2.7 双抗体夹心ELISA 法检测细胞表达的HBSAG |
| 2.8 放免法检测转染细胞表达的GHRH 和SS |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 RNA 复制子载体与普通载体表达水平比较的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 PIRES-LACZ 载体的构建 |
| 2.2 LACZ 基因在293 和BHK-21 细胞中表达 |
| 2.3 LACZ 基因小鼠肌肉中的表达水平 |
| 2.4 GHRH 基因在293 和BHK-21 细胞中的表达 |
| 2.5 GHRH 基因在小鼠肌肉中的表达 |
| 2.6 HBSAG-SS 基因在293 和BHK-21 细胞的表达 |
| 2.7 HBSAG-SS 基因在小鼠肌肉中的表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 RNA 复制子载体与普通载体基因表达水平的比较 |
| 3.2 甲病毒RNA 复制子载体的生物安全性问题 |
| 4 小结 |
| 第四章 微球介导GHRH、SS 和GHRH-SS RNA 复制子表达载体在小鼠体内的表达及对生长的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 PLGA-MP 的制备以及性质考察 |
| 2.2 微球介导GHRH、HBSAG 和SS 基因在小鼠肌肉内的表达 |
| 2.3 微球介导GHRH 和SS 及双基因的RNA 复制子表达质粒在肌肉组织的表达对小鼠生长的影响 |
| 2.4 微球介导 HBsAg 和 SS RNA 复制子表达质粒基因免疫小鼠试验 |
| 2.5 微球介导GHRH 和SS 及双基因的RNA 复制子表达质粒在妊娠母鼠肌肉组织的表达对子代小鼠生长的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 PLGA-MP-DNA 的制备方法和性质 |
| 3.2 影响PLGA-MP 质量的因素 |
| 3.3 PLGA-MP 的安全性 |
| 3.4 PLGA-MP-DNA 对基因表达和免疫效果的影响 |
| 3.5 RNA 复制子对SS 融合基因的免疫效果和促生长作用的影响.. |
| 3.6 微球介导GHRH 和SS 基因的RNA 复制子表达质粒在肌肉组织的表达对小鼠生长的影响 |
| 3.7 GHRH 和SS 基因RNA 复制子表达质粒在妊娠母鼠肌肉组织的表达对子代小鼠生长的影响 |
| 3.8 GHRH 和HBSAG-SS 双基因共表达对小鼠促生长的协同作用 |
| 4 小结 |
| 第五章 微球介导GHRH、SS 和GHRH-SS RNA 复制子表达载体在猪体内的表达及对生长和免疫机能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 微球介导HBSAG-SS基因RNA复制子表达质粒在肌肉组织的表达对育肥猪生长及免疫机能的影响 |
| 2.2 微球介导GHRH 和HBSAG-SS 基因以及双基因RNA 复制子表达质粒在妊娠母猪肌肉组织的表达对后代仔猪生长及免疫机能的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 SS 基因主动免疫的效果及其对育肥猪生长的影响 |
| 3.2 微球介导GHRH 和HBSAG-SS 基因RNA 复制子表达质粒在妊娠母猪肌肉组织的表达对后代仔猪生长的影响 |
| 3.3 微球介导GHRH 和HBSAG-SS 基因RNA 复制子表达质粒在肌肉组织的表达对猪免疫机能的影响 |
| 3.4 微球介导GHRH-HBSAG-SS双基因RNA复制子表达质粒在肌肉组织的共表达对猪生长和免疫的协同作用 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士期间发表的学术论文及其它成果 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 致谢 |
| 导师及作者简介 |
| CURRICULUM VITAE |
（10）HBV感染影响TRAIL诱导凋亡关键基因片段的筛选及其分子机制的研究（论文提纲范文）
| 中文部分 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 总体技术路线 |
| 第一部分 影响TRAIL诱导凋亡的HBV基因片段的筛选及其作用研究 |
| 第一节 反义封闭HBx、HBpreS2表达的体外抗病毒效应 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 PS-asODNs／HBx、PS-asODNs／preS2的设计、合成和溶解 |
| 2.2 PS-asODNs／HBx、PS-asODNs／preS2的体外抗病毒效应 |
| 结果 |
| 1.PS-asODNs／HBx、PS-asODNs／preS2对HBV抗原表达的影响 |
| 2.PS-asODNs／HBx、PS-asODNs／preS2对HBV DNA含量的影响 |
| 讨论 |
| 第二节 反义封闭HBx、HBpreS2的表达对TRAIL诱导细胞凋亡的影响 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 HepG2.2.15细胞对TRAIL敏感性的检测 |
| 2.2 反义封闭HBx、HBpreS2的表达对TRAIL诱导细胞凋亡的影响 |
| 结果 |
| 1.HepG2.2.15细胞对TRAIL敏感性的检测 |
| 1.1 倒置显微镜下观察形态学变化 |
| 1.2 MTT法检测细胞杀伤率 |
| 1.3 可溶性DR5蛋白阻断TRAIL的细胞毒效应 |
| 2.反义封闭HBx、HBpreS2的表达对TRAIL诱导细胞凋亡的影响 |
| 2.1 倒置显微镜下观察形态学变化 |
| 2.2 MTT法检测细胞杀伤率 |
| 2.3 TUNEL流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 讨论 |
| 第三节 反义封闭HBx、HBpreS2对TRAIL受体表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 半定量RT-PCR检测TRAIL受体mRNA水平的表达 |
| 2.2 Western blot检测TRAIL受体蛋白质水平的表达 |
| 2.3 流式细胞术检测TRAIL受体蛋白质水平的表达 |
| 结果 |
| 1.半定量RT-PCR检测TRAIL受体mRNA水平的表达 |
| 2.Western blot检测TRAIL受体蛋白质水平的表达 |
| 3.流式细胞术检测TRAIL受体蛋白质水平的表达 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 HBx、MHBs(t)的表达对TRAIL诱导凋亡的影响及其机制的体外研究 |
| 第一节 含HBx、MHBs(t)基因片段真核表达载体的构建及表达 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 HBx、MHBs(t)基因片段的PCR扩增、回收及纯化 |
| 2.2 目的基因与载体的连接和重组子的转化 |
| 2.3 阳性重组子的筛选与鉴定 |
| 2.4 HBx、MHBs(t)基因稳定转染肝癌细胞系的建立及其鉴定 |
| 结果 |
| 1.HBx、MHBs(t)基因片段的PCR扩增、回收及纯化 |
| 1.1 PCR扩增HBx、MHBs(t)基因片段 |
| 1.2 回收、纯化PCR产物 |
| 2.pcDNA-HBx、pcDNA-MHBs(t)真核表达载体的构建及鉴定 |
| 2.1 目的基因和载体的酶切回收 |
| 2.2 目的基因与载体的连接、转化 |
| 2.3 阳性重组子的筛选和鉴定 |
| 3.HBx、MHBs(t)基因稳定转染肝癌细胞系的建立及其鉴定 |
| 3.1 试剂盒小量提取质粒 |
| 3.2 肝癌细胞系BEL7402对TRAIL敏感性的检测 |
| 3.3 阳性细胞克隆的筛选 |
| 3.4 稳定筛选细胞的鉴定 |
| 讨论 |
| 第二节 HBx、MHBs(t)的表达对TRAIL诱导凋亡的影响 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 MTT法检测不同浓度TRAIL对细胞生长的抑制效应 |
| 2.2 倒置显微镜下观察形态学变化 |
| 2.3 TUNEL流式细胞术检测TRAIL诱导的凋亡效应 |
| 结果 |
| 1.MTT法检测细胞杀伤率 |
| 2.倒置显微镜下形态学观察 |
| 3.TUNEL流式细胞术检测细胞凋亡率 |
| 讨论 |
| 第三节 HBx、MHBs(t)的表达促进TRAIL诱导凋亡的机制研究 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 胞膜受体水平的检测 |
| 2.2 胞浆凋亡通路水平的检测 |
| 结果 |
| 1.HBx、MHBs(t)的表达对TRAIL受体水平的影响 |
| 1.1 半定量RT-PCR检测TRAIL受体mRNA水平的表达 |
| 1.2 Western blot检测TRAIL受体蛋白质水平的表达 |
| 1.3 流式细胞术检测TRAIL受体蛋白质水平的表达 |
| 2.HBx、MHBs(t)的表达对TRAIL凋亡通路分子表达或活化的影响 |
| 2.1 Caspase 3活化水平的检测 |
| 2.2 线粒体非依赖途径 |
| 2.3 线粒体依赖途径 |
| 讨论 |
| 第四节 小干扰RNA封闭Bax的表达对HBx影响TRAIL诱导凋亡的逆转效应 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 阳性对照小干扰RNA载体对GAPDH表达的抑制效率 |
| 2.2 有效封闭Bax表达的小干扰RNA载体的筛选 |
| 2.3 封闭Bax的表达对HBx上调TRAIL诱导凋亡的影响 |
| 2.4 封闭Bax的表达对TRAIL凋亡通路分子活化水平的影响 |
| 结果 |
| 1.阳性对照小干扰RNA载体有效抑制GAPDH的表达 |
| 1.1 成功构建GAPDH小干扰RNA载体和阴性对照载体 |
| 1.2 阳性对照小干扰RNA载体有效抑制GAPDH的表达 |
| 2.有效封闭Bax表达的小干扰RNA载体的筛选 |
| 2.1 Bax小干扰RNA载体的DNA测序结果及序列分析 |
| 2.2 小干扰RNA载体对Bax表达的抑制效应 |
| 3.封闭Bax的表达可逆转HBx对TRAIL诱导凋亡的影响 |
| 4.封闭Bax的表达对TRAIL凋亡通路分子活化水平的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 HBx的表达影响TRAIL诱导凋亡的体内研究 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 2.1 试剂盒大量提取质粒pcDNA3、pcDNA-HBx |
| 2.2 腺病毒的体外扩增、滴度测定及体外活性检测 |
| 2.3 HBx基因及TRAIL腺病毒在小鼠肝组织内的表达 |
| 2.4 HBx的表达对TRAIL腺病毒介导的肝脏损伤的影响 |
| 结果 |
| 1.试剂盒大量提取质粒 |
| 2.TRAIL腺病毒的体外扩增、滴度测定和体外活性检测 |
| 2.1 倒置显微镜下观察腺病毒感染后的细胞病变 |
| 2.2 空斑形成试验测定病毒滴度 |
| 2.3 TRAIL腺病毒体外活性检测 |
| 3.HBx在小鼠肝组织内的表达 |
| 3.1 半定量RT-PCR检测HBx mRNA水平的表达 |
| 3.2 Western blot检测HBx蛋白质水平的表达 |
| 4.HBx的表达增强TRAIL腺病毒诱导肝细胞凋亡 |
| 4.1 小鼠血清谷丙转氨酶水平 |
| 4.2 各器官组织病理学改变 |
| 4.3 PI流式细胞术检测肝细胞凋亡 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 英文部分 |
| Preface |
| Part I Preliminary screening and study of valuable HBV fragments for effects on TRAIL-induced apoptosis |
| Section 1 Effects of blocking HBx, HBpreS2 expression on HBV antigen synthesis and HBV DNA replication |
| Materials and methods |
| 1. Materials |
| 2. Methods |
| 2.1 Design,synthesis and preparation of PS-asODNs/HBx,PS-asODNs/preS2 |
| 2.2 Antiviral effects of PS-asODNs/HBx, PS-asODNs/preS2 in vitro |
| Results |
| 1. Inhibition of PS-asODNs/HBx, PS-asODNs/preS2 on the expression of HBsAg, HBeAg |
| 2. Inhibition of PS-asODNs/HBx, PS-asODNs/preS2 on HBV DNA 134 Discussion |
| Section 2 Effects of blocking HBx, HBpreS2 expression on TRAIL-induced apoptosis |
| Materials and methods |
| 1. Materials |
| 2. Methods |
| 2.1 Sensitivity of HepG2.2.15 cells towards TRAIL |
| 2.2 Effects of blocking HBx, HBpreS2 expression on TRAIL-induced apoptosis |
| Results |
| 1. Sensitivity of HepG2.2.15 towards TRAIL |
| 1.1 Morphological changes |
| 1.2 Results of MTT assay |
| 1.3 Blockade of TRAIL cytotoxicity by sDR5 |
| 2. Effects of blocking HBx, HBpreS2 expression on TRAIL-induced apoptosis l40 |
| 2.1 Morphological changes |
| 2.2 Cytotoxicity rate detected by MTT assay |
| 2.3 Apoptosis rate detected by TUNEL |
| Discussion |
| Section 3 Effects of blocking HBx, HBpreS2 on the level of TRAIL receptors 142 Materials and methods |
| Materials and methods |
| 1. Materials |
| 2. Methods |
| 2.1 mRNA expression of TRAIL receptors |
| 2.2 Protein expression of TRAIL receptors detected by Western blot |
| 2.3 Protein expression of TRAIL receptors detected by FCM |
| Results |
| 1. mRNA expression of TRAIL receptors detected by RT-PCR |
| 2. Protein expression of TRAIL receptors detected by Western blot |
| 3. Protein expression of TRAIL receptors detected by FCM |
| Discussion |
| Conclusion |
| Part II Effects of HBx,MHBs(t) on TRAIL-indcued apoptosis and their molecular mechanisms in vitro |
| Section 1 Construction and expression of eukaryotic expression vectors containing HBx or MHBs(t) |
| Materials and methods |
| 1. Materials |
| 2. Methods |
| 2.1 Amplification, extraction and purification of HBx and MHBs(t) genes |
| 2.2 Ligation and Transformation |
| 2.3 Screening and identification of positive recombinants |
| 2.4 Establishment and identification of stably-transfected hepatoma cells |
| Results |
| 1. Amplification, retrieval and purification of HBx, MHBs(t) genes |
| 1.1 PCR amplification of HBx and MHBs(t) genes |
| 1.2 Retrieval and purification of PCR products |
| 2. Construction and identification of pcDNA-HBx and pcDNA-MHBs(t) |
| 2.1 Digestion and retrieval of interest genes and vectors |
| 2.2 Ligation and transformation |
| 2.3 Screening and identification of positive clones |
| 3. Establishment and identification of stably transfected hepatoma cells |
| 3.1 Extraction of recombinant plasmids |
| 3.2 Sensitivity of BEL7402 towards TRAIL |
| 3.3 Screening of postivie clones |
| 3.4 Identification of stably-transfected cells |
| Discussion |
| Section 2 Effects of HBx and MHBs(t) expression on TRAIL-induced apoptosis 161 Materials and methods |
| Materials and Methods |
| 1. Materials |
| 2. Methods |
| 2.1 Cytotoxicity of TRAIL |
| 2.2 Morphologic changes of cells induced by TRAIL |
| 2.3 Apoptosis rate detected by TUNEL |
| Results |
| 1. Cytotoxicity rate detected by MTT |
| 2. Morphorlogic changes under inverted microscope |
| 3. Apoptosis rates detected by TUNEL |
| Discussion |
| Section 3 Molecular mechanisms of HBx and MHBs(t) effects on TRAIL-induced apoptosis |
| Materials and methods |
| 1. Materials |
| 2. Methods |
| 2.1 Extracellular detection |
| 2.2 Intracellular detection |
| Results |
| 1. Effects of HBx and MHBs(t) on the expression of TRAIL receptors |
| 1.1 Semi-quantitative RT-PCR |
| 1.2 Western blot |
| 1.3 Flow cytometry |
| 2. Effects of HBx,MHBs(t) on TRAIL-pathway molecules |
| 2.1 Activation level of caspase 3 |
| 2.2 Mitochondria-independent pathway |
| 2.3 Mitochondria-dependent pathway |
| Discussion |
| Section 4 Reversion of Bax siRNA on HBx-enhanced TRAIL-induced apoptosis.178 Materials and methods |
| Materials and methods |
| 1. Materials |
| 2. Methods |
| 2.1 Inhibition of positive control siRNA vector on GAPDH |
| 2.2 Selection of effective siRNA vector for Bax |
| 2.3 Effects of Bax blockade on HBx-enhanced TRAIL-induced apoptosis |
| 2.4 Effects of Bax blockade on the activation of TRAIL-signaling molecules 183 Results |
| Results |
| 1. Inhibition of positive control siRNA vector on GAPDH |
| 1.1 Successful construction of positive and negative siRNA vectors |
| 1.2 Effective inhibition of GAPDH by positive control siRNA vector |
| 2. Selection of efficient siRNA vector for Bax |
| 2.1 DNA sequencing of Bax siRNA vectors |
| 2.2 Inhibition of Bax expression by siRNA vector |
| 3. Reversion of Bax siRNA on HBx-enhanced TRAIL-induced apoptosis |
| 4. Effects of Bax siRNA on the activation of apoptotic pathway molecules |
| Discussion |
| Conclusion |
| Part III Study of HBx effects on TRAIL-induced apoptosis in vivo |
| Materials and methods |
| 1. Materials |
| 2. Methods |
| 2.1 Extraction ofpcDNA3 and pcDNA-HBx in bulk |
| 2.2 In vitro amplification, titration, activity detection of adenovirus |
| 2.3 Expression of HBx and Ad-TRAIL in mouse liver |
| 2.4 Effects of HBx on the liver injury induced by TRAIL adenovirus |
| Results |
| 1. Extraction of plasmids in bulk |
| 2. Amplification, titration and activity detection of adenovirus |
| 2.1 Cytopathic effects of HEK293 cells infected with adenovirus |
| 2.2 Plaque formation assay |
| 2.3 Activity of TRAIL adenovirus |
| 3. Expression of HBx in mouse liver |
| 3.1 Semi-quantitative RT-PCR for HBx mRNA |
| 3.2 Western blot for HBx protein |
| 4. Effects of HBx expression on TRAIL-induced apoptosis in vivo |
| 4.1 ALT level in serum |
| 4.2 Pathological changes in different tissues |
| 4.3 Apoptosis of hepatocytes |
| Discussion |
| Conclusion |
| 中英文共用目录 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| Acknowledgements |
| 博士在读期间发表论文、论着目录及所获荣誉 |
| Publications and honors |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
四、HBV PreS2+S/IFN-α融合基因真核表达载体的构建及其表达（论文参考文献）
- [1]HBV外膜蛋白结构域的稳定表达及治疗性抗体的研究[D]. 吉萍. 河南科技大学, 2012(04)
- [2]口服沙门菌递送治疗性HBV-HSP70融合DNA疫苗的实验研究[D]. 刘泽. 中国人民解放军军医进修学院, 2011(10)
- [3]C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究[D]. 张德庆. 山东农业大学, 2011(08)
- [4]天府肉鹅α干扰素基因克隆、表达及其生物学活性研究[D]. 刘菲. 四川农业大学, 2011(02)
- [5]畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究[D]. 刘栋. 山东农业大学, 2010(05)
- [6]融合基因S2S/IFNα对小鼠免疫反应的影响[J]. 陈红梅,白雪帆,任广立. 胃肠病学和肝病学杂志, 2009(12)
- [7]DHBV侵染规律和preS蛋白原核表达及在评价抗人类乙肝新药的应用[D]. 陈宗艳. 四川农业大学, 2008(01)
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- [9]RNA复制子对基因表达的促进作用及动物促生长方法的探讨[D]. 任晓慧. 吉林大学, 2007(03)
- [10]HBV感染影响TRAIL诱导凋亡关键基因片段的筛选及其分子机制的研究[D]. 梁晓红. 山东大学, 2006(12)