一、马传贫驴白细胞弱毒疫苗株基质蛋白基因的克隆与表达（论文文献综述）
王雪峰[1]（2011）在《马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程病毒基因的进化研究》文中提出20世纪70年代,哈尔滨兽医研究所研制成功的马传染性贫血病毒（Equine Infectious Anemia Virus, EIAV）弱毒疫苗为控制马传染性贫血（Equine InfectiousAnemia,EIA）在我国的流行做出了重要的贡献。该研究成果荣获1982年国家发明一等奖。该疫苗克服了慢病毒疫苗的开发难点,能在被免疫动物体内产生坚强的保护性免疫,是迄今为止唯一广泛应用并证明确实有效的慢病毒疫苗。马传染性贫血弱毒疫苗的成功,其中必定蕴藏着慢病毒致弱或诱导保护性免疫的机制,在HIV疫苗开发屡受挫折的背景下,系统阐明EIAV疫苗的减毒和保护机理,为HIV等慢病毒疫苗的研究提供参考。EIAV弱毒疫苗是由自然野毒株经马体、驴体和体外培养的驴外周血白细胞及驴胎皮肤细胞长期传代培养而成。本文通过PCR和RT-PCR的方法分别扩增EIAV弱毒疫苗制备过程中不同代次病毒株的前病毒基因组序列、EIAV驴白细胞弱毒疫苗（EIAVDLV121）及其亲本毒株EIAVLN40感染马匹后5个月内病毒S2/gp90序列,并进行序列分析比较。研究结果表明：（1）EIAV在体外传代致弱过程中LTR、env和S2等区域是主要的变异区域：随着病毒在体外传代培养次数的增加,各病毒株与亲本毒株的遗传距离逐渐增加；伴随着病毒毒力的逐渐减弱,在基因组的各个区域出现了一系列稳定变异位点,包括Gag的100A/T、103T/S和484D/N的替换;Pol的16K/E、598K/R和619N/D的替换；gp90的46A/E、98G/R、103H/Y、189K/E、190E/K、193S/N、236D/-、237N/K、247E/K和321K/E的替换；Tat的7R/H的替换；S2的41T/I、51T/I和55Q/K的替换；Rev的74V/I的替换；LTR负调节区的细胞因子AP-1结合位点、增强子区E box基序、R区的转录起始位点和TAR的起始位点的变异。（2）EIAVLN40在体内进化过程中病毒分为两个大的分支,感染早期和无症状阶段的病毒处在同一分支,发病阶段的病毒和EIAVLN40处在进化树的另一分支;gp90的变异主要分布在8个变异区,V3、V4和V5区的糖基化位点的变化通常与发病状态有关,EIAVLN40和多数发病后的序列在这三个区域都具有糖基化位点191NSSN194、237NNTW240和280NDTS283；病毒进化过程中,S2有12%以上的氨基酸出现稳定的替换,这些变异的出现与疾病发展相关。（3）EIAVDLV121在体内进化过程中病毒gp90分成三个大的分支,各时间点分离的病毒gp90与EIAVLN40的平均差异在0.91%-6.49%之间,与EIAVDLV121的差异在3.88%-6.73%之间;病毒S2基因进化过程中分为两个分支,各时间点分离的病毒S2与EIAVLN40的平均差异在0.79%-8.83%之间,与EIAVDLV121的差异在.3.08%-8.14%之间。研究证实：在EIAV弱毒疫苗制备过程中,随着病毒毒力减弱在基因组的各个区域都出现了一系列稳定的变异：EIAVLN40在体内进化过程中gp90和S2的变异与疾病进程的发展相关；EIAVDLV121在体内低水平复制过程中,病毒基因会继续进化,特别是主要的抗原基因gp90的多样性得到进一步丰富,其中包括与强毒株相似的抗原成分。
高华,高旭,姜成刚,赵立平,马学恩,周建华[2]（2009）在《中国株马传染性贫血病病毒S2基因的原核表达及其多克隆抗体制备》文中研究表明本实验为表达马传染性贫血病病毒（EIAV）S2蛋白和制备其抗血清,以EIAV感染性分子克隆pFDDV3-8为模板扩增S2基因,将其克隆于pMD18-T载体中,测序验证后,将S2基因亚克隆于pET-30a表达载体,构建S2基因的重组表达质粒（pET-EIAV-S2）,并转化DH5α受体菌。以终浓度为0.6mmol/L的IPTG诱导,表达的重组蛋白约20ku。Westernblot分析表明,该蛋白可与EIAV的阳性血清反应,具有免疫原性。该重组蛋白通过镍离子亲和层析进行纯化后,免疫新西兰兔。ELISA及westernblot分析表明,制备的兔多克隆抗体与EIAV的S2蛋白发生特异性反应。EIAVS2蛋白的重组表达及其抗体的制备为进一步研究S2辅助蛋白在EIAV复制与致病中的作用,以及S2基因反向遗传研究奠定了基础。
李强[3]（2009）在《马传染性贫血病毒部分致弱毒株体外和体内的进化分析》文中提出我国研制成功的马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株DLV是将一株来源于马体的EIAV强毒LV （辽毒株）经过驴体连续传代100余代使其病毒毒力增强后获得了驴强毒株DV（对马和驴致死率为90%）,然后将该驴强毒株通过驴白细胞体外连续培养驯化120余代,使该毒株病毒毒力丧失的同时又保持了良好的免疫原性,最终培育成功了EIAV驴白细胞弱毒疫苗。将驴白细胞弱毒疫苗株进一步通过驴胎皮肤细胞继代,又获得比驴白细胞弱毒疫苗免疫保护效果更好的驴胎皮肤细胞弱毒疫苗FDDV。为探讨驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株FDDV在免疫成熟马体内的进化规律,本研究采用nest PCR方法对FDDV免疫成熟马（FDDV免疫24个月后）体内的低拷贝的FDDV前病毒基因组DNA进行了分段（5段）扩增和序列分析,旨在找出FDDV长期在免疫马体内的进化规律并推导出其在体内的优势序列,通过与体外FDDV基因组进行比较分析,找到驴胎皮肤细胞弱毒疫苗株FDDV体内体外演化过程中保守及变化区域。最终每段得到5个阳性克隆的序列。通过比较分析发现:免疫马体内LTR与FDDV3-8 LTR的同源率平均为98.8%,env编码的氨基酸序列的同源率平均为96.1%。免疫马体内外FDDV的囊膜蛋白gp90变异较大,与体外gp90相比免疫马体内gp90的N-糖基化位点有增加现象。为阐明EIAV疫苗的致弱机制和免疫保护机理,本研究采用LA-PCR技术对驴白细胞弱毒疫苗株减毒过程中第92代次毒株（DLV92）前病毒基因组DNA进行了扩增和序列分析,旨找出潜在的与毒力变化和免疫保护相关的稳定变异位点和相关特性。本实验成功的得到了8株接近DLV92全长的8Kb的前病毒基因组核酸序列。通过比较分析得出:DLV92与DLV878（疫苗株DLV ,GenBank中登陆号为AF327878）同源率平均为98.1%,与LV877 （EIAV强毒辽宁株LV,GenBank中登陆号为AF327877）核苷酸序列的同源率平均为97.7%。DLV92囊膜蛋白gp90上存在17个N-糖基化位点,与疫苗株DLV878一致,比亲本强毒LV877的囊膜蛋白gp90少4个糖基化位点,比DLV61少2个糖基化位点。本研究结果将为进一步研究EIAV致弱过程中毒力的变化和免疫保护的分子机制奠定基础。
赵识非,朱远茂[4]（2007）在《马传贫驴白细胞疫苗株反式激活蛋白基因的克隆与表达》文中研究表明马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus,EIAV）属于逆转录病毒科慢病毒属,由该病毒引起的马传染性贫血（简称马传贫或EIA）是马属动物的一种非常重要的传染
周涛[5]（2007）在《马传染性贫血病病毒的基因变异与生物学特性研究》文中进行了进一步梳理马传染性贫血病病毒（EIAV），慢病毒属成员，主要引起马属动物慢性、终生感染，以周期性发热、病毒血症、贫血和血小板减少为特征。70年代，EIAV弱毒疫苗通过以下策略成功研制：首先，将马强毒EIAV-L经过驴体体内传代113次，获得了高毒力的驴强毒EIAV-DA；然后，将EIAV-DA经驴白细胞体外传125代，获得弱毒疫苗EIAV-DLA，该疫苗可保护马和驴免受同源和异源的野生型高毒力EIAV的攻击。中国EIAV的弱化过程可以为研究其他慢病毒疫苗提供有益借鉴，然而EIAV-L和EIAV-DLA的分子生物学特性还有待澄清。基于这个原因，本研究中将7匹试验马分别接种EIAV-DLA、vOK8266、vOK8266chltr或者空白对照，之后用EIAV-L对所有试验马进行攻击。vOK8266是EIAV-DLA的感染性分子克隆（命名为pOK8266）的衍生病毒。将pOK8266的5’和3’LTR替换成EIAV-L的5’和3’LTR得到嵌合感染性分子克隆（命名为pOK8266chltr），vOK8266chltr则是pOK8266chltr的衍生病毒。攻毒前后，对每种病毒的体内复制动力学以及抗gp45、p15、p26、p11和p9抗体进行定期监测。此外，对于EIAV两个重要的基因长末端重复序列（LTR）和表面糖蛋白（gp90）的基因型与表型的关系进行探讨。具体研究内容如下：1、免疫期和攻毒期观察试验马EIA疾病进展7匹血清抗EIAV抗体阴性马分别命名为1#、2#、4#、5#，6#、7#和8#。4#和5#接种克隆毒vOK8266，6#和7#接种嵌合毒vOK8266chltr，8#接种疫苗毒EIAV-DLA，1#和2#为接种对照。6个月后，对5匹接种马和2匹接种对照马以野生型强毒EIAV-L攻击。攻毒前后，每天观察各试验马直肠温度和临床症状。免疫期的6个月中，各试验马没有出现发热现象，表明各接种毒株对试验马是安全的，即使vOK8266chltr的LTR是来源于强毒EIAV-L的。攻毒后，1#、2#和7#出现典型的马传贫症状，经过数个发热期后死亡，其余各试验马在攻毒后13个月的观察期内没有出现任何发病症状。2、马体内EIAV的复制动力学为了研究每种病毒在试验马体内的复制情况，攻毒前后对各试验马血浆中病毒RNA载量和外周血单核细胞（PBMC）前病毒DNA载量进行了定期检测。进行检测之前，首先建立了用于检测EIAV基因组的realtime PCR和realtime RT-PCR的标准曲线。攻毒前的大多数时期，vOK8266chltr接种的试验马血浆RNA载量为每毫升血浆104到105拷贝，比vOK8266和EIAV-DLA接种的试验马在同时期的血浆RNA载量要高，后两者的RNA载量一般低于104拷贝。结果表明EIAV-L的LTR比EIAV-DLA在体内有更高的启动子活性。然而，并没有发现PBMC前病毒DNA载量有类似的差异。攻毒后，与未发病马相比，发病马血浆在发热期含有高得多的病毒RNA载量（高于每毫升106拷贝），而在发热间歇期，病毒RNA载量也高于每毫升血浆105拷贝。结果表明高水平的病毒复制可促进疾病进展。攻毒3个月后，多数未发病马检测不到血浆病毒RNA，表明在这些未发病马体内病毒复制受到抑制。然而，攻毒前后的任何采样时期，在发病马和未发病马体内都能检测到前病毒DNA。体内前病毒DNA的持续存在对EIAV持续感染的作用有待于进一步研究。3、抗体反应为了评价感染动物对疫苗毒和强毒的免疫反应，攻毒前后，利用ELISA方法定期检测所有试验马针对病毒gp45、p15、p26、p11和p9的特异性抗体。免疫后，4#和5#体内的抗gp45、p15和p26的抗体早于或高于其它试验马，可能是由于vOK8266chltr在马体内的复制水平高于vok8266和EIAV-DLA。攻毒后，发病的1#和7#体内抗gp45，p15和p26的抗体很快达到峰值并一直维持在高水平，而2#在大多数抗体产生前死亡。与之不同的是，除6#外，其余未发病马体内抗gp45，p15，p26，p11和p9的抗体水平在攻毒后一直不高。攻毒前后，未发病的6#与发病的7#有着相似的抗体水平，这可能是由于它们都接种vOK8266并都用EIAV-L攻击所致。以上结果表明，高的抗体水平与试验马的保护之间没有必然联系。p11和p9抗体只有在攻毒后的发病马体内能被检测到，提示这两种抗体的产生可能预示着EIA的疾病进展。4、体内和体外前病毒gp90的变异趋势病毒gp90和LTR是EIAV基因组变异最大的区域，两者对病毒致病性都起着重要作用。了解这两个基因的变异趋势对研究EIAV控制策略是至关重要的。攻毒前后从定期采集自1#，4#（或5#），7#和8#的白细胞样品中提取总DNA，巢式PCR扩增包含前病毒gp90基因高变区2（V2）到高变区5（V5）的片段。对免疫期获得的序列进行比较分析，结果表明EIAV-DLA的gp90是一个准种，而在EIAV-DLA接种马体后它会变为一个更为复杂的准种。在8#体内，EIAV-DLA序列有向EIAV-L突变的趋势，提示我们可能存在EIAV-DLA毒力返强的危险。免疫了vOK8266和vOK8266chltr的试验马体内病毒gp90也有类似的变化。所有试验马用EIAV-L攻击后，只有EIAV-L的序列被克隆到。发病马体内病毒gp90发生了高度的序列变异，且变异比较集中于V3区，而未发病马体内的gp90只有中等程度的变异。新的发热期伴随着新gp90准种的出现，新准种带有大量的PND变异，提示PND的突变可能对病毒逃避宿主免疫系统的监视起重要作用，免疫逃避可以造成EIAV持续性感染和促进疾病进展。病毒gp90序列的ds／dn值表明机体对病毒的免疫选择压力在发病马的慢性感染期是强阳性的，但是未发病马的免疫选择压力一直较弱。此外，只有在未发病马体内获得了大量gp90缺陷突变体，这可能是使病毒复制水平降低而使感染马存活的原因之一。突变产生的终止密码子多数位于V4区的缺陷“热点”。5、体内和体外前病毒LTR的变异趋势分别从感染EIAV-DA或EIAV-DLA的体外培养驴MDM、感染EIAV-L的马PBMC、定期采集的试验马1#，4#和8#的PBMC等样品中半巢式PCR扩增前病毒LTR。从EIAV-L、EIAV-DA和EIAV-DLA中分别获得11、10和14个LTR序列，比较结果表明LTR-L和LTR-DA都为单一序列，而LTR-DLA则是一个由不同序列构成的准种，提示我们病毒在体外传代弱化的过程是LTR-DLA复杂准种形成的主要原因。在LTR-DLA的U3和R区分别定义了两个高变区。有意思的是LTR-DLA准种接种8#后，LTR-DLA12被迅速选择为优势序列并且此后高度保守。从1#和4#获得的序列也表明LTR在病毒的体内感染过程中是高度保守的。6、不同EIAV毒株LTR的启动子活性研究为了阐明LTR-DLA的高变区A和B的突变对LTR功能的影响，分别从EIAV-L、EIAV-DA和EIAV-DLA中选择1个或2个具有代表性的LTR序列，构建pLTR／CAT系列质粒。通过EIAV-L的LTR R区替换EIAV-DLA的R区获得了2个嵌合pLTR／CAT质粒。在加或不加EIAV-L Tat表达质粒的情况下，pLTR／CAT质粒转染马单核巨噬细胞。结果表明，在体外培养细胞中，所有LTR的基础转录活性都很低，并且它们之间的差异不显着。在共转染Tat表达质粒时，LTR-DLA较EIAV-L和EIAV-DA有更高的LTR启动子增强活性。强弱毒LTR的嵌合体pLTR／CAT质粒的转染结果表明，强弱毒LTR之间启动子活性差异主要是由R区的序列差异造成的，与U3区序列关系不大。特别是LTR TAR起始位置从强毒到弱毒的突变（A到G）改变了TAR的二级结构，这可能会影响Tat与TAR的相互作用。此外，在U3-R交界处发生的核苷酸变异可能会对病毒RNA的合成产生影响。
王雪峰[6]（2007）在《中国马传染性贫血病毒驴强毒株与驴白细胞弱毒疫苗株前病毒全基因组序列分析》文中研究指明马传染性贫血病毒是反转录病毒科慢病毒属的重要成员,是马传染性贫血的病原体。在上世纪七十年代我国成功研制的马传染性贫血白细胞弱毒疫苗,为我国成功控制了马传染性贫血的流行。马传然性贫血白细胞弱毒疫苗的致弱机理将为其他慢病毒疫苗的开发提供借鉴。本文为阐明马传染性贫血弱毒疫苗的致弱机制和免疫保护机理,结合准株理论,利用LA-PCR技术对马传染性贫血病毒驴强毒株（DV）和驴白细胞弱毒疫苗株（DLV）的前病毒DNA分两段进行扩增,挑取多个克隆测序。最后获得10个DLV前病毒序列,4个DV前病毒DNA序列,21个DLV的LTR,19个DV的LTR,并构建了DV的全长克隆。通过分析比较得出,DV前病毒基因组与DLV前病毒基因组的平均差异率是2.8%。其中S2、LTR和env基因差异较大,核苷酸序列差异率分别是4.1%、3.9%和3.1%;S2、S3和env推导的氨基酸的差异率较大,分别是10.4%、5.6%和4.8%。与国外毒株相比,中国马传染性贫血病毒属于独特的一个支系。本实验首次发现体外培养的DLV株的至少有5种类型的LTR混合存在。gp90推导的氨基酸序列上中国EIAV强毒株比弱毒株多2个N-糖基化位点,其中强毒株有3个特有的N-糖基化位点;弱毒株有1个。总之,本文结合准株理论对中国马传贫驴强毒株和白细胞弱毒疫苗株前病毒基因组核苷酸进行分析,对中国马传贫病毒强弱毒株间的一致性变化进行了讨论,并成功构建了DV株的全长基因组克隆,为进一步研究EIAV毒力的变化和免疫保护的分子机制奠定了基础。
耿庆华[7]（2006）在《我国马传染性贫血弱毒疫苗株与美洲流行毒株鉴别诊断方法的建立及标记疫苗的研究》文中认为本研究用PCR方法对马传染性贫血病毒阿根廷流行毒株（Agen-EIAV）感染马外周血白细胞的前病毒DNA进行了分段扩增,克隆和序列测定,并参考Genbank已经发表的马传染性贫血病毒核苷酸序列,应用基因分析软件拼接出Agen-EIAV全基因核苷酸序列。经分析Agen-EIAV株前病毒基因组全长为8227bp,与我国马传贫辽宁强毒株（LN）、马传贫驴白细胞弱毒疫苗株（DLV）及美国代表毒株（AF028232）核苷酸序列比较,同源率分别为65%、65%和75%。与AF028232株gag、pol和env、gp90和gp45基因核苷酸同源率分别为99%、99%、75.6%、69.4%和80.4%;而与我国DLV的同源率分别为79.7%,82.3%,72.8%,65.2%和78.6%。Agen-EIAV株gag和gp90推导氨基酸序列与美国4个毒株的氨基酸序列高度同源,而与我国4个毒株却存在很大的差异。 本研究对接种Agen-EIAV的试验马（16#）出现的四个发热期（23d、40d、51d和70d）的外周血单核细胞前病毒DNAgag和gp90的核苷酸序列进行了监测,结果发现四个发热期中前病毒gag核苷酸序列变化不明显,变异率在1%之内。gp90核苷酸序列变化较大,变异率在8～10%之间,可划分出A1、A2、A3和A4四个高变区。其中A1、A3和A4在马体发病的整个过程中均发生一次变异,而A2区在第三个发热期发生变异后,在第四个发热期又回复了突变。结果表明,gag在马传染性贫血病毒与宿主细胞基因组整合之后非常稳定,可以选择此区域设计鉴别诊断的引物。从gp90推导的氨基酸序列可划分为5个可变区,都与N-连接的糖基化位点有关系,进一步证明马传贫病毒囊膜糖基化位点的变化与毒力相关。 本研究在对马传染性贫血病毒美洲等流行毒株和我国弱毒疫苗株全基因序列比较分析的基础上,共设计了11条引物,用于在病毒接种驴白细胞培养物上进行PCR鉴别诊断引物的筛选,通过试验筛选确定选用在gag区设计的6条引物。通过对2匹健康马（2#和31#）,9匹分别接种我国DLV（1#、9#和10#）、Agen-EIAV（16#、45#和46#）和美国代表毒株（Wyoming-EIAV）（3#、4#和44#）试验马的检测及PCR反应条件的进一步优化,而确定鉴别马传贫病毒美洲流行毒株和我国弱毒疫苗株的套式多重PCR方法。试验结果表明当用引物C1/C2n/C3n进行第二轮PCR扩增时,从我国DLV接种马外周血白细胞中可扩增出与设计相符的两个片段,分别为675bp和400bp,而美洲流行毒株接种马外周血白细胞只能扩增一条675bp的片段;当用引物C1/AF2n/C3n进行扩增时,从我国DLV接种马外周血白细胞中可扩增出一条675bp的片段,而美洲流行毒株接种马外周血白细胞却能扩增出两个片段,分别为675bp和400bp。而健康马外周血白细胞扩增不任何条带。本试验同时对3匹疫苗免疫马、2匹美洲流行毒株慢性传贫马（45#和46#）和4匹急性传贫马（16#、3#、4#和44#）进行了长时间的跟踪检测,分别可在接毒后最早第7-30天从外周血中检出病毒,至接种后12个月大都可以检出。结果表明本试验建立的PCR鉴别诊断方法具有很好的稳定性和可重复性。本试验还用real-time PCR的方法检验本试验建立的PCR鉴别诊断方法的敏感性,结果表明套式多重PCR可以检出我国DLV免疫马最低病
刘益民[8]（2006）在《Tat蛋白对马传染性贫血病毒长末端重复序列启动子活性的影响》文中进行了进一步梳理马传染性贫血病毒（equine infectious anemia virus，EIAV）属于反转录病毒科慢病毒属，是马传染性贫血（equine infectious anemia，EIA，简称马传贫）的病原体。我国的马传贫驴白细胞弱毒疫苗，是迄今为止世界上唯一投入应用的慢病毒疫苗。应用该疫苗成功地控制了我国马传贫的流行，同时该疫苗也是研究慢病毒免疫预防非常有价值的模型。反转录病毒前病毒基因组长末端重复序列（LTR）对病毒复制有重要的调控作用，影响到病毒的复制动力学、细胞嗜性、致病力等方面。 马传染性贫血病毒弱毒疫苗株在培育过程中LTR发生了两处稳定突变，分别是Tat反式激活区域（Tat activating region，TAR）的起始碱基G到A和poly（A）附加位点C到A的突变。本研究将EIAV强毒力毒株、白细胞弱毒（EIAV-DLA）、驴胎皮肤细胞弱毒（EIAV-FDD）的LTR，以及TAR起始碱基、poly（A）附加位点突变的LTR分别克隆到pCAT3-basic质粒中，获得位于报告基因氯霉素乙酰转移酶（CAT）上游的不同LTR重组质粒。同时将马传贫病毒反式激活蛋白Tat克隆于真核表达载体pCDNA3.1（+），获得了Tat蛋白的表达。将Tat表达质粒分别与不同LTR克隆共转染驴胎皮肤细胞，考察Tat对LTR启动子活性的增强作用。研究发现，在皮肤细胞中Tat蛋白可以特异性增强来源于皮肤细胞弱毒疫苗LTR的启动子活性，而对白细胞源性LTR无明显增强作用。TAR起始位点和poly（A）的单碱基突变和联合突变对Tat的反式激活作用并无明显影响，提示TAR茎环结构的起始位点单碱基突变不能影响与Tat相互作用。
左咏梅[9]（2006）在《马传染性贫血病毒LTR关键点突变对DLV致弱机理的研究》文中研究说明马传染性贫血病毒（equine infectious anemia virus,EIAV）可以引起马属动物的一种急性烈性传染病,以贫血、持续感染、反复发热为特征,终生持续感染,是马属动物最重要的传染病之一。EIAV与人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）同属逆转录病毒科、慢病毒属成员,两者在抗原特性、基因组结构等方面极为相似,以及从经济与安全性角度上考虑,EIAV将是研究HIV乃至慢病毒的最理想的动物模型。沈荣显等科学家于20世纪70年代通过体外细胞传代致弱路线研制成功了马传贫驴白细胞弱毒疫苗,是迄今世界上唯一大规模成功应用的慢病毒疫苗,揭示该疫苗的免疫保护机制,可为研究HIV等其它慢病毒疫苗提供有价值的借鉴。为了阐明我国马传染性贫血病毒弱毒疫苗毒力致弱的分子机制,利用我国马传染性贫血病毒疫苗培育系统（由强毒到弱毒的不同代次病毒）,对EIAV弱毒疫苗致弱过程中不同代次EIAV毒株非编码区LTR序列分析,发现病毒致弱的基因变异规律性位点,即LTR R区序列呈现规律性变化:TAR结构起始位置碱基在59代之前多数为A,而64代之后均为G;poly（A）附加位点在45代之后（除55代外）一致表现为AA,提示这些突变引起的位点或结构变化很可能与病毒毒力减弱有直接关系。因此基于EIA代次毒株LTR序列分析结果,选取EIAV基因非编码区LTR R区作为研究对象,以驴胎皮肤弱毒疫苗感染性分子克隆pLGFD3-8为父本操作系统进行基因的定点突变,即LTR R区的TAR结构起始碱基由弱毒株的G变为强毒株特征A,poly（A）附加位点碱基由弱毒株的AA变为强毒株特征CA,形成具有四处点突变型强弱嵌合感染性的分子克隆。构建EIAV非编码区强弱毒嵌合的全基因分子克隆,将阳性重组质粒命名为pLGFD-M。将该嵌合克隆体外转染驴胎皮肤细胞（FDD）并进行FDD传代,通过逆转录酶活性试验、前病毒DNA PCR扩增、RT-PCR方法及实时定量RT-PCR等试验验证其转染结果。结果显示,LTR嵌合克隆衍生病毒感染FDD出现明显的细胞病变,电镜下可见大量典型的EIAV颗粒,将其病毒命名为vpLGFD-M;细胞培养上清可检测到RT酶活性;前病毒DNA PCR扩增和RT-PCR均为阳性。在细胞水平上对该嵌合克隆衍生毒及其亲本感染性分子克隆毒株复制能力进行了检测,发现此嵌合克隆衍生病毒比其父本克隆衍生病毒的复制水平略高些,保持了亲本皮肤弱毒疫苗感染分子克隆的复制特点和细胞嗜性。本研究在分子生物学方面的新发现是——明确了EIAV LTR反转录时,病毒RNA是先由5’LTR的R-U5与3’LTR U3重组形成前病毒基因组一端的长末端重复序列“新”3’LTR,在新形成的3’LTR上的启动子和转录基因的指导下,进行EIAV的复制与蛋白质的合成。本项研究对进一步在分子水平上阐明我国EIAV疫苗株的复制机制和减毒机理具有极其重要的意义,为进一步确定我国马传贫弱毒疫苗株毒力致弱及免疫保护的分子机制奠定了重要的分子生物学基础,并将为其它人和动物慢病毒的免疫预防研究提供试验依据。
涂亚斌[10]（2005）在《马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程中env基因的变异及LTR的作用》文中研究说明马传染性贫血病毒（equine infectious anemia virus,EIAV）属反转录病毒科慢病毒属,是马传染性贫血（EIA,简称马传贫）的病原体。我国的马传贫驴白细胞弱毒疫苗,是迄今为止世界上唯一投入应用的慢病毒疫苗,该疫苗在我国已成功地控制了马传贫的流行,是研究慢病毒免疫预防非常有价值的模型。反转录病毒前病毒基因组长末端重复序列（LTR）对病毒复制有重要的调控作用,影响到病毒的繁殖动力学、组织嗜性、致病力等方面。反转录病毒的囊膜蛋白,由于其基因的高度变异性,受到病毒学研究的普遍关注,通过对马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒与其亲本强毒L株前病毒全基因组核苷酸序列的比较分析,发现二者的LTR和env基因（尤其是gp90编码区）差异较大。 为了研究env基因gp90在我国EIAV-DLA致弱过程中的作用,我们以EIAV强毒辽宁株（L株）接种健康马,从不同时期发热期马血清中以RT-PCR扩增包含完整S2基因和gp90基因片段;同时以EIAV-DLA接种健康驴白细胞并用RT-PCR扩增相同的基因片段,将所得的强弱毒共30个env基因gp90进行序列分析及进一步推导的氨基酸序列进行分析发现,强弱毒gp90序列存在着多个位点高度的一致性变异,所推导的氨基酸也存在19个位点极其一致性变异,这些变异包括氨基酸的点突变和插入或缺失,其中,氨基酸在极性与非极性之间的变换及氨基酸的插入和缺失造成糖基化数量非常一致的变化。在对其它慢病毒（如HIV、SIV）研究过程中发现,糖基化对病毒的细胞嗜性、毒力以及病毒逃避中和抗体的能力起到了致关重要的作用。经过序列及氨基酸的比较后发现,gp90基因V3到V5区在强毒和弱毒之间差异显着,而在各自内部相对保守,变异较小。对27个S2基因进行序列分析及进一步推导的氨基酸序列进行分析发现,S2基因中也存在着3个非常一致的点突变,没有碱基的插入或缺失。 在对我国强毒EIAV-L和弱毒EIAV-DLA env基因变异研究的基础上,我们将马传贫强、弱毒gp90全长及部分（V3-V5区）分别连接到逆转录病毒载体pBABE-puro,通过转染将马传贫强、弱毒env基因整合到包装细胞系PA317中,利用抗性筛选到稳定表达细胞系;然后将马传贫强、弱毒gp90全长及V3-V5区分别连接到高效真核表达载体pcDNA3.1（+）,转染293T细胞系并经抗性筛选及亚克隆后获得高效稳定表达马传贫强弱毒gp9及V3-V5区基因的细胞系,为研究gp90及V3-V5区结构与功能打下了良好的基础。然而,我们至今对弱毒疫苗的致弱机理尚不清楚。对以HIV为主的慢病毒研究表明LTR和env基因中N-连接糖基化与病毒的嗜性、感染性和抗体中和作用密切相关。我国马传染性贫血病毒强弱毒env基因之间N-连接糖基化存在明显的区别;根据强弱毒env基因变异的分析结果,构建了一系列N-连接糖基化突变分子克隆,力图对N-连接糖基化在我国马传染性贫血病毒致弱过程中的作用进行阐述,通过转染驴白细胞并盲传10代后仍未获得N-连接糖基化突变病毒,我们推测可能的原因是由于N-连接糖基化的突变均位于env基因的V3-V5区,影响了在驴白细胞上的细胞嗜性。 为了探讨LTR在EIAV病毒复制和转录过程中的作用,并进一步研究EIAV的致病和免疫机制,我们在已构建EIAV-DLA株感染性分子克隆和EIAV-L株前病毒DNA全基因组分子克隆的基础上,用EIAV-L株的LTR和gp90编码区分别替换EIAV-DLA株感染性分子克降的相应片段,
二、马传贫驴白细胞弱毒疫苗株基质蛋白基因的克隆与表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、马传贫驴白细胞弱毒疫苗株基质蛋白基因的克隆与表达（论文提纲范文）
（1）马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程病毒基因的进化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 马传染性贫血病毒概述 |
| 1.1.1 EIAV形态结构和理化特性 |
| 1.1.2 EIAV的细胞嗜性 |
| 1.1.3 EIAV的致病性 |
| 1.2 EIAV的分子生物学特特性 |
| 1.2.1 EIAV的复制过程 |
| 1.2.2 EIAV基因组结构 |
| 1.2.3 EIAV的基因及其编码蛋白 |
| 1.3 国内外不同EIAV毒株及其分子特征 |
| 1.4 我国EIAV弱毒疫苗致弱路线及研究进展 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 EIAV弱毒疫苗制备过程中前病毒基因组变异分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 EIAV前病毒基因组的扩增 |
| 2.2.2 EIAV弱毒疫苗致弱过程中前病毒基因组遗传进化分析 |
| 2.2.3 EIAV弱毒疫苗致弱过程中前病毒基因组变异分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 3 EIAV弱毒疫苗亲本强毒株EIAVLN40的进化特点 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 EIAVLN40感染马匹临床症状 |
| 3.2.2 目的片段的扩增与序列比较分析 |
| 3.2.3 EIAVLN40的GP90基因进化特点 |
| 3.2.4 EIAVLN40的S2基因进化特点 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 EIAVLN40 GP90的变异与疾病发展的关系 |
| 3.3.2 EIAVLN40 S2的变异与致病性的关系 |
| 3.4 结论 |
| 4 EIAV驴白细胞弱毒疫苗在体内进化特点 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 EIAVDLV121免疫马匹临床症状 |
| 4.2.2 目的片段的扩增与序列比较分析 |
| 4.2.3 EIAVDLV121的GP90基因在体内的进化特点 |
| 4.2.4 EIAVDLV121的S2基因在体内的进化特点 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 5 论文结论与创新点 |
| 5.1 论文结论 |
| 5.2 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）马传染性贫血病毒部分致弱毒株体外和体内的进化分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪 论 |
| 1.1 EIAV 的历史和研究现状 |
| 1.2 EIAV 形态结构和理化特性 |
| 1.3 EIAV 的生物学特性 |
| 1.3.1 EIAV 的血凝性 |
| 1.3.2 EIAV 的细胞嗜性 |
| 1.3.3 EIAV 的致病性 |
| 1.4 国内外EIAV 毒株及特性 |
| 1.5 中国EIA 弱毒疫苗研制的路线 |
| 1.6 EIAV 的分子生物学研究进展 |
| 1.6.1 gag 基因及其编码蛋白 |
| 1.6.2 pol 基因及其编码蛋白 |
| 1.6.3 env 基因及其编码蛋白 |
| 1.6.4 EIAV 的其它小开放阅读框架及其编码产物 |
| 1.6.5 EIAV 的非编码区一LTR |
| 1.7 课题研究的目的和意义 |
| 第2章 EIAV 驴白细胞弱毒疫苗致弱过程中第92 代次毒株全基因组DNA 的克隆与序列分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒和细胞 |
| 2.1.2 载体和菌株 |
| 2.1.3 试剂及药品 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 驴白细胞的分离与培养 |
| 2.2.2 DLV92 前病毒基因组DNA 的提取 |
| 2.2.3 DLV92 全序列的PCR 扩增 |
| 2.2.4 DLV92 PCR 产物的克隆及测序 |
| 2.2.5 序列分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 DLV92 前病毒DNA 的PCR 扩增产物及所得阳性克隆的鉴定 |
| 2.3.2 DLV92 全序列核苷酸比较分析 |
| 2.3.3 DLV92 LTR 序列比较分析 |
| 2.3.4 DLV92 gag 基因比较分析 |
| 2.3.5 DLV92 pol 基因比较分析 |
| 2.3.6 DLV92 env 基因比较分析 |
| 2.3.7 DLV92 51 基因比较分析 |
| 2.3.8 DLV92 52 基因比较分析 |
| 2.3.9 DLV92 53 基因比较分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 DLV92 LTR 的变异及生物学分析 |
| 2.4.2 DLV92 gag 和pol 的变异分析 |
| 2.4.3 DLV92 env 的变异分析 |
| 第3章 免疫马体内EIAV 驴胎皮肤细胞疫苗株基因组的克隆与序列分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒与免疫马 |
| 3.1.2 载体和菌株 |
| 3.1.3 试剂及药品 |
| 3.1.4 培养基 |
| 3.1.5 引物 |
| 3.1.6 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 免疫马体内FDDV 前病毒基因组DNA 的提取 |
| 3.2.2 免疫马体内FDDV 各片段序列的PCR 扩增 |
| 3.2.3 PCR 产物的克隆及测序 |
| 3.2.4 序列分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 免疫马体内FDDV 前病毒DNA 的PCR 扩增产物及所得阳性克隆的鉴定 |
| 3.3.2 免疫马体内FDDV LTR 序列比较分析 |
| 3.3.3 免疫马体内FDDV gag 基因比较分析 |
| 3.3.4 免疫马体内FDDV pol 基因比较分析 |
| 3.3.5 免疫马体内FDDV env 基因比较分析 |
| 3.3.6 免疫马体内FDDV S1 基因比较分析 |
| 3.3.7 免疫马体内FDDV S2 基因比较分析 |
| 3.3.8 免疫马体内FDDV S3 基因比较分析 |
| 3.3.9 免疫马体内FDDV 的优势序列 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（4）马传贫驴白细胞疫苗株反式激活蛋白基因的克隆与表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 前病毒DNA模板的制备 |
| 1.3 反式激活蛋白tat基因的扩增和克隆 |
| 1.4 反式激活蛋白tat基因的表达 |
| 2 结果 |
| 2.1 反式激活蛋白tat基因的扩增与克隆 |
| 2.2 反式激活蛋白tat的表达 |
| 3 讨论 |
（5）马传染性贫血病病毒的基因变异与生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 马传染性贫血病病毒概述 |
| 1.1.1 慢病毒属的构成 |
| 1.1.2 EIAV的历史及分类地位 |
| 1.1.3 EIAV的形态和理化特性 |
| 1.1.4 EIAV的血凝性 |
| 1.1.5 EIAV的细胞嗜性和体外培养 |
| 1.1.6 EIAV的致病性 |
| 1.1.7 EIAV检测技术的发展 |
| 1.2 EIAV的分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 EIAV的基因组结构概述 |
| 1.2.2 表面糖蛋白gp90 |
| 1.2.3 穿膜蛋白gp45 |
| 1.2.4 EIAV gp90和gp45的变异 |
| 1.2.5 机体针对gp90和gp45的免疫应答 |
| 1.2.6 EIAV gag蛋白概述 |
| 1.2.7 机体针对gag的免疫应答 |
| 1.2.8 非编码区LTR的序列特征 |
| 1.2.9 LTR与细胞因子的相互作用 |
| 1.2.10 LTR影响病毒的细胞嗜性 |
| 1.2.11 LTR对病毒致病性影响的研究 |
| 1.2.12 Tat蛋白对LTR启动子活性的影响 |
| 1.3 反向遗传操作研究EIAV |
| 1.4 慢病毒疫苗的研究进展 |
| 第2章 研究目的与意义 |
| 第3章 材料与方法 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 毒株 |
| 3.1.2 细胞 |
| 3.1.3 试验动物 |
| 3.1.4 质粒与菌株 |
| 3.1.5 细胞培养用试剂 |
| 3.1.6 细菌培养用试剂 |
| 3.1.7 大肠杆菌感受态制备用试剂 |
| 3.1.8 操作核酸用试剂 |
| 3.1.9 寡核苷酸引物与探针 |
| 3.1.10 ELISA缓冲液和包被蛋白 |
| 3.1.11 β-gal和CAT定量检测试剂盒 |
| 3.1.12 其他试剂 |
| 3.1.13 仪器与器材 |
| 3.1.14 生物软件 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 细胞的制备与培养 |
| 3.2.2 EIAV接种细胞 |
| 3.2.3 EIAV接种试验马 |
| 3.2.4 监测试验马临床症状 |
| 3.2.5 定期采集试验马血液样品 |
| 3.2.6 建立realtime PCR标准曲线 |
| 3.2.7 建立realtime RT-PCR标准曲线 |
| 3.2.8 测定EIAV前病毒DNA载量 |
| 3.2.9 测定EIAV病毒RNA载量 |
| 3.2.10 血清抗体检测 |
| 3.2.11 测定EIAV前病毒gp90和LTR序列 |
| 3.2.12 EIAV gp90和LTR的序列分析 |
| 3.2.13 pLTR/CAT系列质粒的构建 |
| 3.2.14 LTR启动子活性研究 |
| 第4章 结果与分析 |
| 4.1 EIAV的免疫与攻毒 |
| 4.1.1 免疫和攻毒期间的临床观察 |
| 4.2 免疫和攻毒期间的病毒复制特性研究 |
| 4.2.1 Realtime PCR标准曲线的建立 |
| 4.2.2 免疫期和攻毒期试验马PBMC前病毒DNA载量的变化 |
| 4.2.3 Realtime RT-PCR标准曲线的建立 |
| 4.2.4 免疫期和攻毒期试验马血浆病毒RNA载量的变化 |
| 4.3 免疫和攻毒期间试验马的体液免疫反应 |
| 4.3.1 免疫期和攻毒期试验马血清抗EIAV gp45抗原的抗体变化 |
| 4.3.2 免疫期和攻毒期试验马血清抗EIAV p26抗原的抗体变化 |
| 4.3.3 免疫期和攻毒期试验马血清抗EIAV p15抗原的抗体变化 |
| 4.3.4 免疫期和攻毒期试验马血清抗EIAV p11抗原的抗体变化 |
| 4.3.5 免疫期和攻毒期试验马血清抗EIAV p9抗原的抗体变化 |
| 4.4 免疫期和攻毒期EIAV gp90的进化分析 |
| 4.4.1 PBMC前病毒gp90的扩增与克隆 |
| 4.4.2 免疫期试验马体内gp90的变异分析 |
| 4.4.3 攻毒期试验马体内gp90的变异分析 |
| 4.4.4 攻毒期gp90种群的演化分析 |
| 4.4.5 攻毒后不同时期gp90nt和aa的变异规律 |
| 4.4.6 分析攻毒期间机体对病毒gp90的选择作用 |
| 4.5 体内和体外感染过程中EIAV LTR的变异趋势 |
| 4.5.1 体内或体外感染EIAV的细胞中前病毒LTR的扩增与克隆 |
| 4.5.2 体内传代导致的EIAV LTR的序列变异 |
| 4.5.3 体外传代导致的EIAV LTR的序列变异 |
| 4.5.4 分析EIAV-L与其体内和体外衍生毒株之间的LTR进化关系 |
| 4.5.5 EIAV-DLA LTR在动物体内感染过程中的种群纯化趋势 |
| 4.5.6 攻毒前后未发病马PBMC前病毒LTR的序列分析 |
| 4.5.7 攻毒后发病马PBMC前病毒LTR的序列分析 |
| 4.6 LTR启动子活性的研究 |
| 4.6.1 EIAV LTR启动CAT表达的质粒的构建 |
| 4.6.2 不同LTR启动子在eMDM上启动活性的比较研究 |
| 第5章 讨论与结论 |
| 5.1 讨论 |
| 5.1.1 EIAV的复制动力学 |
| 5.1.2 EIAV LTR的序列与启动子活性研究 |
| 5.1.3 EIAV感染中病毒gp90的变异趋势 |
| 5.1.4 感染EIAV后的机体反应 |
| 5.2 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（6）中国马传染性贫血病毒驴强毒株与驴白细胞弱毒疫苗株前病毒全基因组序列分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 马传染性贫血病毒概述 |
| 1.1.1 EIAV 形态结构和理化特性 |
| 1.1.2 EIAV 的细胞嗜性 |
| 1.1.3 EIAV 的致病性 |
| 1.1.4 国内外 EIAV 毒株及特性 |
| 1.2 马传染性贫血病毒的分子生物学特性别 |
| 1.2.1 EIAV 基因组结构 |
| 1.2.2 EIAV 的基因及其编码蛋白 |
| 1.2.3 EIAV 的非编码区——LTR |
| 1.3 准株理论与 LA-PCR 技术 |
| 1.3.1 准株理论 |
| 1.3.2 LA-PCR 技术及其优势 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒和细胞 |
| 2.1.2 质粒和菌株 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 驴白细胞的分离与培养 |
| 2.2.2 前病毒 DNA 的提取 |
| 2.2.3 EIAV 前病毒 DNA 分段两段扩增和基因克隆 |
| 2.2.4 EIAV 全基因克隆的构建 |
| 2.2.5 测序结果分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 EIAV 前病毒DNA PCR 扩增及不同片段克隆质粒的鉴定 |
| 3.2 DV117 全基因克隆的构建 |
| 3.3 低拷贝载体 PLGW 的构建 |
| 3.4 DV117 和DLV122 前病毒核苷酸全序列和各基因及其编码的氨基酸序列 |
| 3.4.1 LTR 的比较结果 |
| 3.4.2 gag 及其编码氨基酸序列的比较 |
| 3.4.3 pol 基因及其氨基酸序列比较 |
| 3.4.4 env 基因及其氨基酸序列 |
| 3.4.5 S1 基因及其编码的蛋白 Tat |
| 3.4.6 S2 基因及其编码氨基酸序列 |
| 3.4.7 S3 及其编码的rev 蛋白 |
| 4 讨论 |
| 4.1 强弱毒株 LTR 的变异分析 |
| 4.1.1 LTR 序列变异性 |
| 4.1.2 LTR 细胞转录因子结合位点的变化 |
| 4.2 env 的变异及其生物学意义 |
| 4.3 其他基因的变异和生物学意义 |
| 4.4 准株理论与 EIAV 的研究 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（7）我国马传染性贫血弱毒疫苗株与美洲流行毒株鉴别诊断方法的建立及标记疫苗的研究（论文提纲范文）
| 第一章 绪论 |
| 1.1 EIAV的概述 |
| 1.2 EIAV主要基因的变异研究进展 |
| 1.3 EIAV非结构蛋白的研究概况 |
| 1.4 本试验的目的和意义 |
| 第二章 马传染性贫血病毒阿根廷流行毒株前病毒全基因序列测定与分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 仪器 |
| 2.1.5 质粒的小量提取 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 试验动物的接种 |
| 2.2.2 马外周血单核细胞的制备 |
| 2.2.3 前病毒DNA的提取 |
| 2.2.4 前病毒全基因的分段扩增 |
| 2.2.5 前病毒各基因片段PCR产物的克隆与测序 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 前病毒全基因的分段扩增 |
| 2.3.2 各段基因的克隆与鉴定 |
| 2.3.3 Agen-EIAV株各基因片段的序列测定及全基因序列的拼接 |
| 2.3.4 Agen-EIAV株与DLV、LN和AF028232株各基因核苷酸序列比较 |
| 2.3.5 Agen-EIAV株与DLV、LN和AF028232，AF033820，AF016316，M16575株gag核苷酸及其编码蛋白的比较 |
| 2.3.6 Agen-EIAV株与DLV、LN和AF028232，AF033820，AF016316，M16575株gp90核苷酸及其编码蛋白的比较 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 马传染性贫血病毒阿根廷流行毒株前病毒gag和gp90在马体内的变异分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株 |
| 3.1.2 试验动物 |
| 3.1.3 试剂 |
| 3.1.4 仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 四个发热期马外周血的采集、PBMC的制备及 DNA的提取 |
| 3.2.2 四个发热期gag和gp90核苷酸序列的扩增 |
| 3.2.3 四个发热期gag和gp90PCR产物的克隆与测序 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 四个发热期gag和gp90的PCR扩增 |
| 3.3.2 四个发热期gag和gp90的克隆与鉴定 |
| 3.3.3 四个发热期gag和gp90不同克隆的序列测定 |
| 3.3.4 四个发热期gag核苷酸序列比较 |
| 3.3.5 四个发热期gp90核苷酸序列及氨基酸比较 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 我国马传染性贫血病弱毒疫苗株与美洲流行毒株鉴别诊断方法的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株 |
| 4.1.2 试验动物 |
| 4.1.3 试剂 |
| 4.1.4 仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 病毒培养 |
| 4.2.2 马外周血单核细胞的制备 |
| 4.2.3 引物的设计与合成 |
| 4.2.4 模板的制备 |
| 4.2.5 β-actin克隆及序列测定 |
| 4.2.6 每个 DNA样本质量的检测 |
| 4.2.7 病毒培养物 PCR检测条件的摸索 |
| 4.2.8 套式多重 PCR鉴别诊断方法的建立 |
| 4.2.9 试验动物样品的检测 |
| 4.2.10 扩增目的条带的克隆及序列测定 |
| 4.2.11 敏感性试验 |
| 4.2.12 稳定性和重复性试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 β-actin基因的扩增 |
| 4.3.2 β-actin基因克隆的序列测定 |
| 4.3.3 病毒接种细胞培养物套式多重PCR鉴别诊断方法的初步建立 |
| 4.3.4 扩增目的条带的克隆及序列测定 |
| 4.3.5 试验动物 PCR检测条件的优化及样本的检测 |
| 4.3.6 PCR检测的敏感性试验 |
| 4.3.7 稳定性和重复性试验 |
| 4.3.8 动物试验PCR检测结果 |
| 4.3.9 动物试验 PCR检测与琼脂扩散试验检测结果的比较 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 马传染性贫血病标记疫苗的研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.1.3 引物 |
| 5.1.4 质粒的小量提取 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 驴胎皮肤细胞的制备、培养 |
| 5.2.2 重组感染性克隆pLG-5B19和pLG-np2的构建 |
| 5.2.3 重组感染性克隆pLG-5B19和pLG-np2突变序列的测定 |
| 5.2.4 质粒的提取和纯化 |
| 5.2.5 质粒在细胞培养中的转染和传代 |
| 5.2.6 重组感染性克隆pLG-5B19和pLG-np2突变序列的测定 |
| 5.2.7 嵌合病毒复制动力学分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 重组感染性克隆pLG-5B19和pLG-np2的构建及鉴定 |
| 5.3.2 重组感染性克隆pLG-5B19和pLG-np2突变序列的测定 |
| 5.3.3 重组感染性克隆pLG-5B19和pLG-np2的转染 |
| 5.3.4 衍生病毒在 FDD细胞培养的生物学特性研究 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）Tat蛋白对马传染性贫血病毒长末端重复序列启动子活性的影响（论文提纲范文）
| 第一章 文献综述 |
| 一 马传染性贫血病毒概述 |
| 1 EIAV的历史及分类地位 |
| 2 EIAV的形态、理化及生物学特性 |
| 3 EIAV的致病性 |
| 二 马传染性贫血病毒的分子生物学 |
| 1 EIAV基因组的结构 |
| 2 EIAV的基因及其编码的蛋白 |
| 3 EIAV的持续性感染、致病及免疫保护机制 |
| 4 小结 |
| 第二章 研究报告 |
| Tat蛋白对马传贫病毒长末端重复序列启动子活性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 毒株、细胞、质粒 |
| 1.2 酶、试剂及主要仪器 |
| 1.3 质粒的提取 |
| 1.4 PCR |
| 1.5 重组LTR质粒的构建 |
| 1.6 重组EIAV Tat-D与Tat-FDD构建、表达与检测 |
| 1.7 氯霉素乙酰转移酶(CAT)含量的检测 |
| 1.8 重组质粒的转化及酶切鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组LTR质粒的鉴定 |
| 2.2 EIAV Tat-D与Tat-FDD的鉴定 |
| 2.3 pCTM_7-D和pCTM_7-FDD的间接免疫荧光检测 |
| 2.4 CAT ELISA检测结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）马传染性贫血病毒LTR关键点突变对DLV致弱机理的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 马传染性贫血病毒概述 |
| 1.1.1 EIAV 认知历史和现状 |
| 1.1.2 EIAV 形态结构和理化特性 |
| 1.1.3 EIAV 的生物学特性 |
| 1.1.4 EIAV 的致病性 |
| 1.2 马传染性贫血病毒的分子生物学 |
| 1.2.1 EIAV 基因组结构 |
| 1.2.2 EIAV 的基因及其编码蛋白 |
| 1.3 EIAV 基因非编码区LTR 相关研究进展 |
| 1.3.1 EIAV LTR 的结构和生物学功能 |
| 1.3.2 LTR 增强子区与细胞嗜性密切相关 |
| 1.3.3 LTR 存在特异性转录因子基序与病毒致病性密切相关 |
| 1.3.4 LTR 转录因子基序及其变异对病毒复制的影响 |
| 1.3.5 LTR 在中国EIAV 弱毒疫苗致弱过程中的变化 |
| 1.3.6 LTR 在反向遗传学中的应用 |
| 1.4 EIAV 疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 EIAV 疫苗在国外的研究进展 |
| 1.4.2 中国EIAV 疫苗的研究 |
| 1.5 本研究背景、内容和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒和细胞 |
| 2.1.2 质粒和菌株 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 驴胎皮肤细胞FDD 的制备、培养 |
| 2.2.2 EIAV LTR 强弱毒点突变型嵌和病毒的构建 |
| 2.2.3 质粒的提取和纯化 |
| 2.2.4 质粒在细胞培养中的转染和传代 |
| 2.2.5 转染传代后细胞培养物中EIAV 的检查 |
| 2.2.6 点突变型嵌和病毒复制动力学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 EIAV LTR 强弱毒点突变型嵌合克隆的构建 |
| 3.2 衍生病毒收获及体外感染性分析 |
| 3.3 pLGFD-M 点突变型嵌合病毒复制动力学分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 点突变区域的选择及其生物学意义 |
| 4.2 感染性克隆的构建 |
| 4.3 EIAV LTR 点突变型嵌合克隆构建的意义 |
| 4.4 EIAV LTR 点突变型嵌合克隆复制特性和细胞嗜性 |
| 4.5 EIAV LTR 点突变型嵌合克隆对病毒的沉默的影响 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
（10）马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程中env基因的变异及LTR的作用（论文提纲范文）
| 引言 |
| 一、马传染性贫血病病毒概述 |
| 1 国内外EIAV毒株及特性 |
| 2 gag基因及其编码蛋白 |
| 3 pol基因及其编码产物 |
| 4 env基因及其编码产物 |
| 4.1 表面蛋白(SU／gp90) |
| 4.2 跨膜蛋白(TM／gp45) |
| 5 调节蛋白及其编码区 |
| 5.1 Tat蛋白及其作用元件TAR |
| 5.2 S2开放阅读框架(ORF) |
| 5.3 S3开放阅读框架和Rev蛋白 |
| 5.4 EIAV的非编码区——LTR |
| 二、慢病毒与糖基化 |
| 1 SIV与糖基化 |
| 2 HIV与糖基化 |
| 三、本研究的主要内容和意义 |
| 研究报告 |
| 实验一 EIAV-DLA株与其亲本强毒EIAV-L株env基因及S2基因变异分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 质粒和菌株 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 质粒的小量提取 |
| 2 方法 |
| 2.1 驴白细胞的培养 |
| 2.2 EIAV病毒RNA的提取 |
| 2.3 强、弱毒包含完整S2和gp90基因的扩增 |
| 2.4 强、弱毒代表性gp90部分基因的原核表达载休克隆的构建 |
| 2.5 强、弱毒部分gp90蛋白的表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 包含完整S2和gp90基因的克隆与鉴定 |
| 3.2 EIAV-DLA及EIAV-L株gp90核苷酸和氨基酸序列比较 |
| 3.3 从EIAV-L株到DLA后gp90氨基酸比较 |
| 3.4 从EIAV-L株到DLA后gp90氨基酸点突变 |
| 3.5 EIAV-DLA及EIAV-L株S2基因核苷酸和氨基酸序列比较 |
| 3.6 EIAV-DLA及EIAV-L株S2基因氨基酸变异分析 |
| 3.7 强弱毒代表性gp90部分基因的原核表达 |
| 实验二 马传染性贫血强、弱毒gp90在真核细胞系中的稳定表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及细胞系 |
| 1.2 质粒 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 细胞培养用试剂 |
| 1.4.1 Hank's液 |
| 1.4.2 0.25％胰酶 |
| 1.5 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组逆转录病毒载体的构建 |
| 2.2 重组真核表达载体的构建 |
| 2.3 转染用质粒的纯化 |
| 2.4 重组逆转录病毒的产生 |
| 2.5 表达EIAV gp90的SP20的产生 |
| 2.6 RT-PCR检测EIAV gp90在SP-20中的表达 |
| 2.7 表达EIAV gp90的293T细胞系的产生 |
| 2.8 免疫荧光检测EIAV gp90在293T细胞系的表达 |
| 3 结果 |
| 3.1 包含强、弱毒gp90重组逆转录病毒载体的构建 |
| 3.2 包含强、弱毒gp90重组真核表达载体的构建 |
| 3.3 强、弱毒gp90重组逆转录病毒的制备 |
| 3.4 强、弱毒gp90在SP-20中的表达 |
| 3.5 表达强、弱毒gp90真核细胞系293T的筛选 |
| 实验三 EIAV一系列N-连接糖基化突变克隆和嵌合感染性分子克隆的构建及生物学特性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒和菌株 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 引物的合成和克隆或者亚克隆片段的序列测定 |
| 1.4 驴白细胞的分离培养及FDD细胞、EFK细胞的培养 |
| 1.5 主要仪器 |
| 1.6 质粒的提取与纯化 |
| 1.6.1 质粒的小量提取 |
| 1.6.2 质粒的大量提取和纯化 |
| 2 方法 |
| 2.1 pOK-LTR-DLA／L、pOK-env-DLA／L和pOK-LTRenv-DLA／L嵌合分子克隆的构建 |
| 2.2 N-连接糖基化突变分子克隆的构建 |
| 2.2.1 N-191，N-236，N-246突变分子克隆的构建 |
| 2.2.2 N-191+N-236，N-191+N-246，N-236+N-246突变分子克隆的构建 |
| 2.2.3 N-191+N-236+N-246突变分子克隆的构建 |
| 2.3 转染 |
| 2.4 转录酶(RT)活性的测定 |
| 2.5 电镜观察 |
| 2.6 嵌合病毒前病毒基因组的提取 |
| 2.7 嵌合病毒前病毒基因组LTR的扩增及测序 |
| 2.8 动物试验 |
| 2.9 血清抗体的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组质粒pOK-LTR-DLA／L的构建 |
| 3.2 重组质粒pOK-env-DLA／L的构建 |
| 3.3 重组质粒pOK-LTRenv-DLA／L的构建 |
| 3.4 N-191，N-236，N-246突变分子克隆的获得 |
| 3.5 N-191+N-236，N-191+N-246，N-236+N-246突变分子克隆的获得 |
| 3.6 N-191+N-236+N-246突变分子克隆的获得 |
| 3.7 马传染性贫血病毒感染性分子克隆衍生病毒的获得 |
| 3.8 嵌合病毒LTR的扩增及鉴定 |
| 3.9 人工感染马临床表现及血清学检测 |
| 讨论 |
| 1 EIAV env及S2基因变异及其生物学意义 |
| 2 LTR变异对EIAV毒力及细胞嗜性的影响 |
| 3 EIAV env基因点突变对病毒的复制影响及其它结构蛋白特异性抗体对试验马致病性的影响 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、马传贫驴白细胞弱毒疫苗株基质蛋白基因的克隆与表达（论文参考文献）
- [1]马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程病毒基因的进化研究[D]. 王雪峰. 内蒙古农业大学, 2011(12)
- [2]中国株马传染性贫血病病毒S2基因的原核表达及其多克隆抗体制备[J]. 高华,高旭,姜成刚,赵立平,马学恩,周建华. 中国预防兽医学报, 2009(07)
- [3]马传染性贫血病毒部分致弱毒株体外和体内的进化分析[D]. 李强. 黑龙江大学, 2009(03)
- [4]马传贫驴白细胞疫苗株反式激活蛋白基因的克隆与表达[J]. 赵识非,朱远茂. 畜牧兽医科技信息, 2007(12)
- [5]马传染性贫血病病毒的基因变异与生物学特性研究[D]. 周涛. 华中农业大学, 2007(02)
- [6]中国马传染性贫血病毒驴强毒株与驴白细胞弱毒疫苗株前病毒全基因组序列分析[D]. 王雪峰. 内蒙古农业大学, 2007(03)
- [7]我国马传染性贫血弱毒疫苗株与美洲流行毒株鉴别诊断方法的建立及标记疫苗的研究[D]. 耿庆华. 中国农业科学院, 2006(10)
- [8]Tat蛋白对马传染性贫血病毒长末端重复序列启动子活性的影响[D]. 刘益民. 新疆农业大学, 2006(02)
- [9]马传染性贫血病毒LTR关键点突变对DLV致弱机理的研究[D]. 左咏梅. 东北农业大学, 2006(01)
- [10]马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程中env基因的变异及LTR的作用[D]. 涂亚斌. 中国农业科学院, 2005(07)